北美水貂源沙门氏菌的分离鉴定及耐药性检测

刘勃兴 赵安奇 王利丽 张雪佳 郭 蕊 丁家麟 史秋梅* 张志强*

(1.河北科技师范学院，河北省预防重点实验室，秦皇岛，066600；2.昌黎县农业农村局，秦皇岛，066600；3.秦皇岛市海港区西港动物防疫监督站，秦皇岛，066000)

沙门氏菌(Salmonella)病又称副伤寒，是一种在毛皮动物养殖过程常见的急性传染病，常发于6—8月，呈地方性流行，主要表现症状为发热，下痢腹泻，体重减轻，出现神经症状，流产等[1-3]。英国、丹麦、加拿大等国均有北美水貂(Mustelavison)感染沙门氏菌患病的报道，国内，在我国河北、东北三省、山东等地区也有相关病例报道[4-8]。目前，沙门氏菌的预防与治疗以抗生素药物为主。近年来对沙门氏菌的耐药性研究结果显示，人源、动物源沙门氏菌的多重耐药情况和耐药程度逐年递增，并通过饮水和食物等方式在人和动物之间不断传递[9-11]。抗生素类药物滥用，给细菌造成选择压力是造成多重耐药情况日益严重的主要原因之一，因此，在养殖中合理应用治疗动物疾病尤为重要[12]。

本文对2019年秦皇岛地区送检北美水貂的沙门氏菌携带情况进行调查，并对分离菌株的致病性和耐药性进行研究，旨在为该地区北美水貂沙门氏菌病的防治提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 样品

2019年3—9月收集秦皇岛地区病死北美水貂病料65份，30—180日龄不等。

1.2 主要试剂

H.E.琼脂培养基购自青岛海博生物公司；革兰氏染色液购自京博奥拓达科技有限公司；ID32E肠杆菌科和其他非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂条购自法国梅里埃公司；D2000 plus DNA ladder，购自中科瑞泰科技有限公司；2×TaqMaster Mix，细菌DNA基因组提取试剂盒，胶回收试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；pMD19-T载体，购自宝日医(TaKaRa)生物技术有限公司；药敏纸片购自杭州天和微生物科技股份有限公司；序列测定服务由上海生工生物工程公司提供。昆明小鼠(体重20±5 g)购自北京维通利华试验动物有限公司。

1.3 引物

细菌16S rDNA鉴定通用引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列为27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：TAC GGY TACCTTGTTACGACTT。

1.4 细菌的分离纯化

无菌采取病死水貂肝脏、脾脏、心脏，于超净台中接种于H.E.琼脂培养基，置于37℃恒温培养箱中培养18—24 h，挑取黑绿色且中心有黑点的菌落重新于H.E.培养基中划线纯化培养18—24 h，挑取符合上述特征的单菌落接种于LB培养基中，置于37℃恒温摇床培养18—24 h。

1.5 分离菌的革兰氏染色

挑取纯化后的单菌落进行革兰氏染色，染色操作按照试剂说明书进行，染色后在光学显微镜下观察细菌的染色特征和形态。

1.6 分离菌的生化鉴定

生化鉴定试验参照ID32E肠杆菌科和其他非苛养革兰氏阴性杆菌鉴定试剂条进行，用ATB自动生化鉴定系统对结果判定。

1.7 分离菌的16S rDNA鉴定

按照细菌DNA基因组提取试剂盒说明书提取分离菌的DNA作为PCR模板。PCR体系为：上、下游引物和模板各1 μL，ddH2O 22 μL，2×TaqMaster Mix 25 μL，总体积为50 μL。PCR扩增反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30个循环；72℃延伸10 min。用胶回收试剂盒回收1 500 bp左右条带，回收产物连接pMD19-T载体并转入DH5α感受态细胞，涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基培养，挑取阳性菌落置于含氨苄青霉素的LB培养基中增殖培养，送上海生工生物工程公司测序。测序结果在NCBI的BLAST分区检索并比对分析。

1.8 分离菌的致病性试验

参考文献[13]中的剂量与方法，每株分离菌分别感染5只小鼠，每只小鼠腹腔注射0.2 mL用高压灭菌后的PBS调整浓度后的菌液(浓度1×108cfu/mL)，设置对照组一组，每只小鼠注射0.2 mL的无菌PBS，其余条件与分离菌感染组相同。观察并记录小鼠死亡发病情况。

1.9 分离菌的药物敏感性试验

按照美国临床和试验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)标准的操作和判准，采用KB纸片法检测分离菌对β-内酰胺类(氨苄西林、头孢曲松、阿莫西林)，氨基糖苷类(阿米卡星、新霉素、卡那霉素)，四环素类(多西环素、土霉素)，氟喹诺酮类(环丙沙星、恩诺沙星)，氯霉素类(氟苯尼考)，大环内酯类(替米考星)，磺胺类(磺胺间甲氧、磺胺二甲氧、复方新诺明)，共计15种抗生素的敏感性。

2 结果

2.1 细菌的分离纯化

从65份样品中共计分离出9株疑似沙门氏菌的菌株。疑似菌株在H.E.琼脂培养基培养菌落呈圆形，边缘整齐，微凸，蓝绿色，菌落中间有黑点(图1A)。

2.2 分离菌的革兰氏染色

经革兰氏染色，9株分离菌均为革兰氏阴性短杆菌，两端钝圆(图1B)。

2.3 分离菌的生化鉴定

生化鉴定结果显示，分离菌枸橼酸盐，d-葡萄糖，赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶试验均为阳性。个别菌株可发酵麦芽糖、甘露醇。吲哚、尿素酶、丙二酸盐等试验均为阴性。ATB自动生化鉴定系统判定结果均为沙门氏菌，评定符合率均在99%以上。

2.4 分离菌的16S rDNA鉴定

将测序结果用NCBI的BLAST分区检索，发现分离菌株与沙门氏菌属的参考菌株同源性达97%—100%。结合上述鉴定结果，综合判定9株分离菌为沙门氏菌，命名为SDS1-9。

2.5 分离菌的致病性试验

分离菌感染小鼠后，小鼠出现明显的神经症状，表现为站立不稳，眯眼，抱爪蜷缩，个别小鼠出现粪便稀软，呼吸急促症状。感染组小鼠出现死亡，死亡个数1—5个，死亡率20%—100%(图2)。对照组小鼠无发病症状，无死亡。分离感染组小鼠肝脏、脾脏、心脏细菌，经鉴定分离出沙门氏菌。

2.6 分离菌的药物敏感性试验

药物敏感性试验结果显示，分离菌株分别对5—11种抗生素耐药，对2—5种抗生素表现中介，对2—8种抗生素敏感(图3)。15种抗生素中无对头孢曲松和阿米卡星表现耐药的菌株，其余13种抗生素的耐药率11.11%—100%，其中氟苯尼考、替米考星、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和复方新诺明的耐药率高达100%。土霉素敏感率最高，为88.89%(8/9)(图4)。对5种抗生素耐药菌株1株，对6种抗生素耐药菌株2株，对7种抗生素耐药菌株1株，对8种抗生素耐药菌株3株，对9种抗生素耐药菌株1株，对11种抗生素耐药菌株1株，分离菌株均具有多重耐药性。

3 讨论

Williams等[8]报道英国的12个养殖场316只病死貂中沙门氏菌患病率0.6%，Dietz等[7]报道由于饲料污染导致丹麦25个水貂养殖场水貂出现流产死胎，上述报道均表明在水貂养殖中沙门氏菌是重要的细菌性致病原。我国毛皮动物养殖起步较晚，但发展迅速，养殖数量和密度较大，存在养殖技术相对落后，管理粗放等问题，致使动物发病率较高，尤其是细菌性疾病，给养殖场造成严重的经济损失[14-15]。本文对65份病死水貂病料中的沙门氏菌进行分离鉴定，分离率为13.85%，并通过小鼠致病性试验发现分离菌株均具有一定的毒力。李鹏[16]用多重PCR方法检测268份水貂胴体及内脏组织，沙门氏菌检出率0.75%(2/268)；刘亭亭[4]从2009—2017收集的水貂病料中检测出5株沙门氏菌。在李鹏[16]和刘亭亭[4]报道均有沙门氏菌检出，但检出率均比本文低，这可能与检测方法和病料来源、时间等条件不同有关。

沙门氏菌有多种耐药性产生机制，并可通过多种方法从环境中获得耐药性，给沙门氏菌病的防治造成困难[17]。本文对9株水貂源沙门氏菌的耐药性进行研究，发现多重耐药菌株高达100%，而试验的15种抗生素中有5种抗生素耐药性高达100%，表明分离菌株耐药情况较为严重，且部分抗生素对分离菌株未表现出抗菌效果。据孙娜等[18]报道，其分离的7株水貂源沙门氏菌具有多重耐药现象，对头孢曲松、左氧氟沙星、氟苯尼考和多黏菌素较敏感，对氨基糖苷类药物、四环素和氨苄西林表现为耐药。据王海龙等[6]报道，其分离的水貂源沙门氏菌对环丙沙星、左旋氧氟沙星、克林霉素、头孢曲松钠高敏，对万古霉素、硫酸黏菌素中敏，对丁胺卡那霉素、氨苄西林、庆大霉素低敏。在本文与孙娜等[18]、王海龙等[6]的报道中，水貂源沙门氏菌均存在多重耐药现象，且耐药情况不同，这可能是由于时间、饲养与治疗方式不同造成的。在临床治疗水貂沙门氏菌病时，建议可先通过药物敏感性试验筛选出最佳的抗菌药物，制定合理的给药方案，避免长期大剂量使用抗生素，减少养殖户的经济损失。

本文对秦皇岛地区水貂源沙门氏菌进行分离鉴定，分离率13.85%(9/65)；对分离菌株的致病性及耐药性进行研究，发现分离菌均具可致小鼠出现不同程度死亡，并分别对5—11种抗生素药物耐药，氟苯尼考、替米考星、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和复方新诺明的耐药率高达100%，耐药情况较为严重，为该地区水貂沙门氏菌病的预防和治疗提供参考。