浅低温对心肌缺血-再灌注损伤合并脓毒症大鼠模型的心肌保护作用

秦竹韵，申世轩，曲开勇，曹芳芳，张海涛

急性心肌梗死（AMI）与脓毒症均是造成全球主要疾病负担的原因[1-2]。AMI患者进行血管再通治疗后合并脓毒症在心脏重症监护室常见。一项前瞻性研究表明，AMI合并脓毒症的患者死亡风险较单纯AMI患者显著增加[3]。

AMI是由于冠状动脉长时间闭塞所导致，而血流的恢复也会对心肌造成损伤。部分AMI患者因病情较重而导致住院时间延长，易发生院内感染和发展为脓毒症。脓毒症是宿主机体感染后所致的一系列综合征，可导致包括心脏在内的多器官功能障碍[4]。心肌缺血-再灌注（I/R）损伤合并脓毒症可造成心肌的氧化应激损伤、炎症和凋亡。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2（NOX2）是在心肌梗死以及脓毒症中均可产生的一种主要的活性氧物质[5-6]。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）可反映心肌I/R损伤合并脓毒症中心肌炎症情况[7]。此外，胱天蛋白酶-3（caspase-3）的表达增加可反映凋亡的发展[8]。因疾病机制复杂，心肌I/R损伤合并脓毒症目前的临床治疗效果欠佳，目前尚少见有关其治疗的文献报道。

浅低温（32℃～35℃）能降低机体代谢，促进损伤恢复。在动物模型中，浅低温分别被证实可改善心肌I/R损伤和脓毒症的症状[9-10]。因此，浅低温对心肌I/R损伤合并脓毒症可能也有保护作用。本研究通过建立SD大鼠的心肌I/R损伤合并脓毒症疾病模型，从心功能、心肌梗死面积、心肌损伤、氧化应激、炎症和凋亡方面探究浅低温对心肌的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选用健康雄性SD大鼠15只，体重400～600 g，所有动物购于北京维通利华实验动物技术有限公司。实验前予以大鼠清洁饮食，观察7 d，无异常反应。大鼠随机分为3组：心肌I/R损伤合并脓毒症浅低温（MHT）组，心肌I/R损伤合并脓毒症常温（NT）组，假手术常温组作为对照组，每组大鼠选用5只。

1.2 心肌I/R损伤合并脓毒症模型制作

心肌I/R损伤模型按常规方法建立[11]。首先结扎前降支约30 min后抽出尼龙线使血管再通建立缺血再灌注损伤模型，然后抽出尼龙线同时将内毒素（LPS，O111B4,Sigma公司，美国）15 mg/kg腹腔注射至大鼠体内建立脓毒症模型，对照组注射等量生理盐水（NS）。大鼠基础左心室收缩压95～115 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），约15 min后下降至基础值60%～70%左右（约60～80 mmHg）并维持1 h以上表示脓毒症模型建立成功[12]。

1.3 温度控制

实验中大鼠的正常体温在（37.0±0.5）℃，核心体温通过检测肛温实现。注入LPS或生理盐水同时，将MHT组大鼠置于冰床上降温，每隔5 min检测一次肛温，15 min降至目标温度（33.0±0.5）℃，然后维持2 h。NT组及对照组实验全程用加热手术台及红外线灯照射维持在常温，防止大鼠因麻醉所导致的体温丢失。

1.4 观察指标

目标温度维持2 h后，抽取静脉血并处死大鼠取心脏。检测大鼠心肌损伤标志物、心肌病理变化、心肌梗死面积、氧化应激、凋亡和炎症的情况。

1.4.1血流动力学指标 ：实验全程用Powerlab系统记录心率、左心室最大收缩压、左心室舒张末期压力（LVEDp）、收缩期压力最大变化速率（+max dp/dt）及舒张期压力最小变化速率（-min dp/dt）等血流动力学指标的变化。

1.4.2心肌损伤标志物：经颈静脉抽血用酶联免疫吸附测定法检测乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）含量。将血样离心取上清，加样，封板后置 37℃孵育 60 min，再洗涤、拍干，然后加入显色剂于37℃暗处反应 20 min，终止反应后测定吸光度。

1.4.3心肌病理学变化：将大鼠结扎部位以下心肌组织放置在4%多聚甲醛溶液中固定。经乙醇梯度脱水，石蜡包埋，切片，进行苏木精-伊红（HE）染色，然后用光学显微镜观察心肌组织病理形态学变化。

1.4.4心肌梗死面积测定：目标温度维持2 h后，将1 ml 1%氯化三苯基四氮唑（TTC）及2 ml 1%伊文思蓝注入大鼠颈静脉将心脏染色，然后取材。粉红色区域为梗死区，蓝色为非缺血心肌区域。将心脏快速冻至-80℃ 20 min后取出，切成5个约2 mm薄片。图片用Image Pro Plus 6.0软件测量心肌梗死范围，心肌梗死程度用梗死面积占总面积比例表示。

1.4.5免疫印迹法检测NOX2表达：取 20 mg大鼠心脏组织加入裂解液提取总蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转至聚偏氟乙烯膜，用5%脱脂奶的 TBST液封闭 1 h，洗涤 3次，然后用兔抗鼠 NOX2抗体及兔抗鼠 β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体（1∶2 000稀释）孵育，4℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG（1∶2 000稀释），化学发光法进行成像。β-actin作为内参蛋白。用 Image J软件分析条带灰度值，计算NOX2和β-actin比值作为NOX2的相对表达量。

1.4.6免疫组化检测caspase-3和TNF-α 表达：基于HE染色结果，包含心肌梗死区域的心肌组织用石蜡包埋、封闭后，用抗TNF-α 和caspase-3抗体孵育于4℃，过夜。在室温下用二抗孵育1 h。将3,3’-二氨基联苯胺/过氧化氢加到切片表面，室温染色10 min，然后成像。计算caspase-3或TNF-α 阳性细胞背景与总细胞背景的比值作为caspase-3或TNF-α 相对表达量。

1.5 统计学方法

实验结果采用SPSS 26.0软件进行处理，计量资料用均数±标准差（）表示。两组间均数比较使用独立样本t检验，多组间比较使用重复测量的方差分析，两两比较用LSD法（方差齐时）或用Dunnett T3法（方差不齐时），非正态分布资料比较用 Kruska-Wallis检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 浅低温对血流动力学的影响（表1）

MHT组再灌注2 h心率较NT组降低[（396.63±39.93）次/min vs.（457.74±32.77）次/min，P＜0.05]；左心室最大收缩压升高[（129.14±34.05）mmHg vs.（85.63±14.74）mmHg，P＜0.05]，差异均有统计学意义；MHT组+max dp/dt再灌注2 h较NT组及对照组升高，但差异无统计学意义；LVEDp和-min dp/dt再灌注2 h绝对值也较NT组及对照组均有所增加，但差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

2.2 浅低温对心肌损伤的影响（表2、图1）

NT组LDH及CK-MB显著高于对照组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。MHT组LDH及CK-MB均高于对照组，但差异均无统计学意义（P均＞0.05）。MHT组LDH及CK-MB均显著低于NT组，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。HE染色光镜下MHT组心肌细胞相对完整，心肌坏死呈点状或灶状，心肌间质淤血程度轻且炎细胞浸润较少。NT组的心肌出现水肿、灶状或片状坏死，心肌间质区淤血程度重及存在大量炎细胞浸润。对照组心肌细胞排列整齐，结构完整。

2.3 浅低温对心肌梗死面积的影响

对照组心肌无明显缺血区，MHT组及NT组出现心肌梗死。MHT组与NT组相比，心肌梗死面积比率明显减少[（11.23±2.82）% vs.（19.25±4.45）%，P＜0.05]，差异有统计学意义。

2.4 浅低温对心肌氧化应激的影响（表3、图2）

免疫印迹法检查结果显示，NT组及MHT组NOX2表达少量增加。NT组NOX2的相对表达量较对照组增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。MHT组NOX2的相对表达量较对照组增加，差异无统计学意义（P＞0.05）。MHT组较NT组相对表达量减少，但差异亦无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠不同时间段的血流动力学数据变化（n=5，）

表1 各组大鼠不同时间段的血流动力学数据变化（n=5，）

注：NT：常温；MHT：浅低温；+max dp/dt：收缩期压力最大变化速率；-min dp/dt：舒张期压力最小变化速率；LVEDp：左心室舒张末期压力。与对照组比较*P＜0.05；与NT组比较Δ P＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa

表2 浅低温维持2 h后各组大鼠LDH和CK-MB水平比较（U/L，n=5，）

表2 浅低温维持2 h后各组大鼠LDH和CK-MB水平比较（U/L，n=5，）

注：NT：常温；MHT：浅低温；LDH：乳酸脱氢酶；CK-MB：肌酸激酶同工酶。与对照组比较*P＜0.05；与NT组比较△P＜0.05

图1 浅低温维持2 h后光镜下各组大鼠心肌组织病理学变化（×200）

表3 浅低温维持2 h后各组大鼠NOX2、caspase-3及TNF-a相对表达量（%，n=5，）

表3 浅低温维持2 h后各组大鼠NOX2、caspase-3及TNF-a相对表达量（%，n=5，）

注：NT：常温；MHT：浅低温；NOX2：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2；caspase-3：胱天蛋白酶-3；TNF-α：肿瘤坏死因子-α。与对照组比较*P＜0.05;与NT组比较△P＜0.05

图2 浅低温维持2 h后各组大鼠免疫印迹法NOX2表达情况

2.5 浅低温对心肌凋亡及炎症的影响（表3、图3）

免疫组化检测NT组caspase-3及TNF-a的相对表达量较对照组显著增高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。MHT组caspase-3及TNF-a的相对表达量均较对照组升高，但差异均无统计学意义（P均＞0.05）。MHT组caspase-3及TNF-a的相对表达量较NT组降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

图3 浅低温维持2 h后光镜下各组大鼠免疫组化分析中caspase-3（3A）及TNF-α（3B）的表达（×200）

3 讨论

本研究成功建立SD大鼠心肌I/R损伤合并脓毒症模型，并通过在模型中应用浅低温证实其可改善心肌的收缩和舒张功能，减少心肌梗死面积，减轻心肌损伤，也有抗心肌氧化应激、凋亡和炎症反应的作用。

浅低温在其他动物实验中已被证实有正性肌力的作用，可以改善心脏收缩及舒张功能。Huang等[13]在一项将心跳骤停的动物实验中应用浅低温，发现+max dp/dt、-min dp/dt和心输出量增加，提示心脏收缩及舒张功能均有改善，本研究结果与此类似。本研究中的MHT组中，心率较前降低，但LVEDp、左心室最大收缩压、+max dp/dt及-min dp/dt均有上升，提示大鼠的心输出量增加。而NT组中虽然心率增加，但心脏的舒缩压及速率均较基线减少，提示大鼠心功能受损。这证实在心肌I/R损伤合并脓毒症中存在心功能损害，浅低温有改善心脏收缩及舒张功能的作用。然而，MHT组及浅低温维持2 h后+max dp/dt、LVEDp和-min dp/dt结果较NT组及对照组差异均无统计学意义，究其原因可能是因为大鼠样本较少，或低温时间需延长等。

既往动物实验表明，浅低温可减少心肌I/R损伤的梗死面积，但对于降温时机存在争议。Dash等[14]的一项在猪心肌I/R损伤模型研究中，降温时机选在再灌注前30 min，结果示心肌梗死面积明显减少。Kanemoto等[15]研究显示，在开始再灌注时降温，可最大限度减少心肌梗死面积。Marek-Iannucci等[16]在心肌I/R损伤猪模型中选择再灌注后30 min降温，心肌梗死面积也有所减少。然而，Hale等[17]在兔心肌I/R损伤模型中将降温时机应用在再灌注后30 min，结果显示虽然浅低温可改善无复流现象，但心肌梗死面积并未减少。在本研究中，降温时机在再灌注同时，MHT组的心肌梗死面积较NT组心肌梗死面积显著减少，这与Kanemoto等[15]研究结果一致，提示即使在心肌I/R损伤合并脓毒症的情况下，在再灌注治疗同时降温也可减少心肌梗死面积。

本研究显示，浅低温减少心肌梗死面积是通过减轻心肌损伤实现的。心肌损伤时，包括LDH和CK-MB在内的心肌损伤标志物释放入循环中，LDH和CK-MB的升高可协助AMI的诊断，其升高程度可代表心肌受损程度[18]。本实验中，MHT组中的LDH和CK-MB较NT组减低，且MHT组和对照组升高程度相比差异无统计学意义，证明浅低温可以缓解心肌损伤。此外，在病理学层面上，HE染色直接显示MHT组心肌受损程度较NT组明显减轻，心肌坏死较NT组少，且炎细胞浸润较少。

NOX2是AMI和脓毒症中均可产生的氧化应激相关物质[5-6]。本研究显示NOX2在MHT组较NT组表达减少，但差异无统计学意义，可能与样本量较少有关。此外，在本实验中，心肌I/R损伤合并脓毒症导致提示炎症反应的炎症标志物TNF-α 及提示心肌细胞凋亡的caspase-3升高，而浅低温有改善心肌炎症及抗心肌细胞凋亡的作用。

综上所述，本研究从心功能、心肌梗死面积、心肌损伤程度、氧化应激、炎症及凋亡几方面证实了浅低温在心肌I/R损伤合并脓毒症的心肌保护作用，为临床心肌I/R损伤合并脓毒症的危重患者的治疗提供了动物研究基础。然而，本实验通过注射LPS建立的脓毒症模型与临床上病原微生物导致的脓毒症有区别，且大鼠与人之间物种之间的差别可导致结果不一致，故浅低温对为临床心肌I/R损伤合并脓毒症患者的有效性有待进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突