基于氨基酸分析的乳品掺假鉴别研究

谢立娜 锁 然 赵 燕

（1.河北农业大学食品科技学院，河北保定 071000； 2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全重点实验室，北京100081）

我国是一个人口大国，奶及奶制品 （奶粉等）的消费占世界乳品供应的很大比例。奶类具有极大的营养价值[1]，不同品种的奶质量也有所不同。近年来，随着我国乳品行业的迅速发展，乳品的种类多种多样，有些不良商家为了获取更高经济利益，以价格较低的牛奶代替昂贵的羊奶、骆驼奶等[2]，这不仅对人们是一种欺骗行为，还不利于消费市场稳定。因此，探寻一种安全、准确鉴别乳品种类的方法具有重要意义。

乳品中含有丰富的营养物质，如蛋白质和矿物质。蛋白质是组成人体一切细胞、组织的重要成分，对维持机体正常的生命活动具有极其重要的作用[3]。而氨基酸是蛋白质的主要组成部分，它是衡量食品营养价值的一项重要指标，且可作为特征指标进行食品品种鉴别及掺假鉴别。陈媛媛等[4]利用氨基酸自动分析仪测定了不同品种蚝汁中游离氨基酸含量，最后筛选出丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、苏氨酸和组氨酸作为蚝汁特征氨基酸。赖玉婷等[5]通过柱前衍生高效液相色谱法对牛奶及奶粉中的色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸进行测定，建立牛奶及奶粉的氨基酸模式，可有效判别出牛奶及奶粉的蛋白掺假。

氨基酸的测定分析方法较多，传统的方法主要是采用氨基酸自动分析仪测定，该方法由MOORE等[6]在1959 年提出。国内外已将氨基酸自动分析仪专用为氨基酸的检测手段[7]。但该方法对氨基酸检测分析的专用性强，且仪器的价格昂贵，不能广泛应用于其他化学成分的分析，局限性较大。近20 年来，随着键合反相色谱的应用及柱前衍生化技术的发展，氨基酸的检测分析更多采用高效液相色谱法，与氨基酸自动分析仪相比，该方法具有分离效果好，灵敏度高，通用性强的优点，且快速、操作简单，可用于多种物质的分析，越来越受到人们的青睐[8～10]。柱前衍生高效液相色谱分析指样品组分经过化学反应转变为发光或发色衍生物，再经色谱柱分离后被检测[11]。柱前衍生的关键在于衍生剂的选择。衍生化所用试剂通常有邻苯二甲醛（OPA）、2，4-二硝基氟苯（FDNB）、丹酰氯 （Dansy-Cl）、磺酰氯二甲胺偶氮苯 （Dabsyl-Cl）、氯甲酸芴甲酯 （9-芴基甲氧基羰酰氯，FMC）、异硫氰酸苯酯 （PITC）等[12～15]，各种衍生剂各有优势与不足[13]。近年来，2，4-二硝基氯苯（CDNB）作为一种新型的柱前衍生化试剂应用于氨基酸的测定分析中，其柱前衍生方法和仪器分析条件与FDNB 法类似，但与FDNB 法相比，具有衍生试剂价廉易得，理化性质稳定，制备试样简单方便的优点[16]。同时，与其他衍生剂相比具有干扰小，重现性好，毒性小，衍生条件简单等优点[17～19]。本研究以2，4-二硝基氯苯为衍生剂，通过柱前衍生高效液相色谱法对牛奶、马奶、驴奶、骆驼奶4 种乳品中的17 种氨基酸含量进行检测分析，结合单因素方差分析和主成分分析（PCA）区分奶类样品的来源，进而保证乳品的质量安全。

一、材料与方法

（一）材料与试剂牛奶、马奶、驴奶、骆驼奶样品采购于牧场。牛奶共3 份样品，全部取自内蒙古呼和浩特市； 马奶共4 份样品，其中2 份样品取自新疆乌鲁木齐市，2 份样品取自内蒙古锡林郭勒盟； 驴奶共3 份样品，其中1 份样品取自山东聊城市，2 份样品取自新疆乌鲁木齐市； 骆驼奶共3份样品，全部取自新疆乌鲁木齐市。

17 种氨基酸标准品： 天冬氨酸（Asp）、组氨酸（His）、谷氨酸（Glu）、精氨酸（Arg）、丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr）、丙氨酸 （Ala）、脯氨酸 （Pro）、缬氨酸 （Val）、甲硫氨酸 （Met）、胱氨酸（Cys）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸 （Leu）、苯丙氨酸 （Phe）、赖氨酸 （Lys）、酪氨酸 （Tyr）（纯度≥99%，北京拜尔迪生物技术公司和美国Sanland 公司）； 2，4-二硝基氯苯 （分析纯，纯度≥99%，上海源叶生物科技有限公司）； 乙腈 （色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司）； 乙酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、冰乙酸、三乙胺 （分析纯，纯度≥99%，上海麦克林生化科技有限公司）； 盐酸 （优级纯，上海麦克林生化科技有限公司）； 实验所需用水为娃哈哈纯净水。

（二）仪器与设备Waters 2695 高效液相色谱仪 （美国 Waters 公司），低压梯度泵，PDA 检测器； 电热鼓风干燥箱 （天津市泰斯特仪器有限公司）； SHD-Ⅲ型循环水式多用真空泵 （保定高新区阳光科教仪器厂）； 电热恒温水浴锅 （北京市长风仪器仪表公司）； 电子天平 （北京赛多利斯仪器有限公司）。

（三）试验方法

1.样品处理。将液态样品冷冻干燥后，准确称取0.5 g （精确至0.000 1 g）冻干粉于安培瓶中，加入 6 mol/L 的盐酸10 mL，在 110℃条件下水解24 h。静置，冷却到室温，容量瓶定容至 10 mL，然后取1 mL 水解液于真空条件下抽干，再加入0.1 mol/L 盐酸溶液 2 mL 回溶，混匀备用。

2.氨基酸的衍生。取标准溶液或样品水解液100 μL 于 1.5 mL 进样瓶中，加入缓冲溶液 200 μL和 300 mg/mL 衍生剂 100 μL，漩涡混匀，在 90℃恒温水浴锅中避光反应90 min，反应结束后冷却至室温，加入 10%乙酸 50 μL 调节 pH 为中性，然后用水定容到1 mL，涡旋混匀，最后取上清液过0.45 μm 有机膜后待测。

3.溶液配制。（1）300 mg/mL 衍生剂： 称取0.3 g 2，4-二硝基氯苯溶于 1 mL 乙腈中获得300 mg/mL 2，4-二硝基氯苯衍生剂。（2）缓冲溶液： 称取0.53 g Na2CO3和0.42 g NaHCO3分别溶于 10 mL水中，取 700 μL Na2CO3溶液加入到 10 mL NaHCO3溶液中，调节 pH 值为 9.0。（3）氨基酸标准曲线：分别称取一定量的17 种氨基酸标准品于100 mL容量瓶中，用 0.1 mol/L 盐酸溶液定容，混匀，配制成浓度为1 000 mg/L 的氨基酸混合标准储备液，于4℃保存备用。然后将储备液稀释成50、100、125、200、250、300、400、500 mg/L 的氨基酸混合标准溶液，于4 ℃保存备用。

4.色谱条件。色谱柱为Kromat Universil C18柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）； 柱温为 40℃； 检测波长为 360 nm； 流量为 1 mL/min； 进样量为 10 μL； 流动相： A 为乙腈，B 为 2.5 g/L 乙酸钠 （含1.5 mL 三乙胺，用冰乙酸调至 pH 5.25）。梯度洗脱程序见表1。

（四）数据统计方法以各种氨基酸的质量浓度为横坐标 （x），氨基酸的峰面积为纵坐标 （y），进行线性拟合，得到氨基酸标准溶液的线性回归方程，并以 3 倍信噪比 （S/N＝3）计算检出限，10倍信噪比计算定量限。

表1 梯度洗脱程序

采用SPSS 22.0 对样品氨基酸数据进行分析，采用单因素方差分析 （ANOVA）和 Duncan 多重比较分析以确定不同来源乳样中氨基酸含量的差异。通过SIMCA 14.1 对标准化的数据进行主成分分析 （PCA），将不同来源的乳样进行分类，并计算氨基酸的变量投影重要度 （VIP）值，筛选出鉴别乳样来源的关键氨基酸。

二、结果与讨论

（一）线性范围、检出限与定量限将不同浓度的氨基酸标准溶液衍生后，供 HPLC 分析检测。线性回归方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限见表2，可以看出，17 种氨基酸在50～500 mg/L 范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.991 4～0.999 8； 检出限为 0.40～2.35 mg/L，定量限为1.33～7.83 mg/L。

表2 氨基酸的线性回归方程、相关系数、检出限及定量限

（二）方法精密度、稳定性及重现性为考察方法的精密度，准确称取0.5 g 奶类样品，经水解、衍生后，连续进样6 次以色谱峰峰面积为指标计算相对标准偏差 （RSD），17 种氨基酸的 RSD 为1.02%～4.27%（n＝6）。为考察衍生物的稳定性，将衍生的氨基酸标准溶液于室温放置0、1、2、3、4、5 d 后 进 行 测 定 ，计 算 其 RSD 为 1.76%～5.09% （n＝6）。为考察方法的重现性，各取牛奶、马奶、驴奶、骆驼奶同一样品 6 份，经水解、衍生后测定色谱峰峰面积，计算其RSD，得出牛奶、马奶、驴奶、骆驼奶中17 种氨基酸的RSD 分别为1.37%～5.15%、1.69%～5.20%、1.73%～5.40%、1.81%～5.67%（n＝6）。方法的精密度、稳定性及重现性分析得到的RSD 结果见表3。结果表明，该方法精密度高、稳定性好、重现性好，符合实验室测定要求，可应用于奶类样品中17 种氨基酸的测定分析。

（三）加标回收率准确称取0.5 g 奶类样品，添加50、300、500 mg/L 3 个浓度水平的氨基酸标准溶液，每个添加水平做6 份平行样品，经水解、衍生后，进HPLC 分析和回收率测定。牛奶样品中氨基酸的回收率测定结果见表4，其平均回收率为89.1%～110.0%。其中赖氨酸、甲硫氨酸与酪氨酸回收率较低，可能是由于高温使其部分氧化。

（四）乳品中氨基酸含量的测定分析

1.不同来源乳品中氨基酸含量的差异。牛奶、马奶、驴奶、骆驼奶4 种奶类样品中氨基酸含量测定结果的平均值见表5。由结果可见，骆驼奶氨基酸总量最高，其次是马奶、牛奶、驴奶。其中天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、脯氨酸、亮氨酸、赖氨酸

含量均较高，而组氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、酪氨酸含量较低。4 种奶均含有丰富的必需氨基酸，这7 种必需氨基酸之和所占比率均在30%以上，依次为牛奶、骆驼奶、驴奶、马奶。经方差分析可知，17 种氨基酸含量在4 种奶类样品间都具有显著性差异 （p＜0.05），其中精氨酸区分效果最好。

表3 方法的精密度、稳定性及重现性分析测得的RSD （%）

表4 牛奶样品中氨基酸的回收率 （%）

表5 奶类样品中氨基酸的含量 （mg/g）

2.不同来源乳品的主成分分析。通过氨基酸数据对不同来源的奶类样品进行主成分分析，其主成分的特征向量值和方差贡献率见表6。由表可知，前3 个主成分因子得分的累计方差贡献率为94.003%，其中第 1 主成分的方差贡献率为60.628%，第2 主成分的方差贡献率为23.594%，第3 主成分的方差贡献率为9.780%，前3 个主成分包括了大多数变量的信息。不同来源奶类样品的主成分得分见图1，可以看出，根据氨基酸数据，牛奶、马奶、驴奶和骆驼奶得到较好的分类效果。通过对氨基酸数据进行化学计量学分析，本研究得到了在区分4 种奶中起关键作用的氨基酸，如图2所示。一般认为变量投影重要度 （VIP）值＞1 的指标对模型贡献率高，即表示为在乳源鉴别中起重要作用的关键指标，最后发现精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸和天冬氨酸具有较高的 VIP 值。其中精氨酸的 VIP 值为 1.35，甘氨酸的 VIP 值为 1.24，赖氨酸的 VIP 值为 1.22，胱氨酸的 VIP 值为 1.18，丙氨酸的 VIP 值为 1.17，酪氨酸的 VIP 值为 1.13，天冬氨酸的 VIP 值为1.09。以上结果表明，氨基酸可作为鉴别牛奶、马奶、驴奶和骆驼奶不同品种奶类样品的特征指标。

表6 不同来源乳品主成分的特征向量值及方差贡献率

图1 4 种奶类样品的主成分分析得分图

图2 17 种氨基酸的重要性分布

三、结论

本文通过带有二极管阵列检测器的高效液相色谱法测定了牛奶、马奶、驴奶、骆驼奶4 种奶的氨基酸含量，采用加热水解法，以2，4-二硝基氯苯为衍生剂，梯度洗脱进行测定，17 种氨基酸的标准工作曲线呈良好的线性关系，方法的精密度分析中 RSD 为 1.02%～4.27% （n＝6），稳定性分析中RSD 为 1.76%～5.09% （n＝6），重现性分析中RSD 为 1.37%～5.67% （n＝6）。同时，经方差分析、主成分分析，很好地鉴别了4 种不同来源的奶类样品，确定了起关键作用的氨基酸依次为精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸和天冬氨酸。该方法操作简单，精密度、稳定性、重现性较好，可应用于奶类样品中氨基酸的测定，进而鉴别不同来源的奶类样品，为鉴别奶制品掺假研究提供技术支持及数据支撑。