HSP70及其磷酸化在下肢动脉硬化闭塞症中的表达及临床意义

霍鑫 曹治婷 蔡许超

[摘要] 目的 分析下肢动脉硬化闭塞症（LEASO）患者不同阶段热休克蛋白70（HSP70）及其磷酸化水平的差异及其临床意义。 方法 收集2017年9月至2019年12月在柳州市人民医院收治的80例下肢动脉硬化闭塞症（LEASO）患者的血样，按踝肱指数（ABI）分为A组（ABI≤0.430）和B组（ABI>0.430）。采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定本院患者各阶段HSP70的表达，分析两组HSP70浓度及ABI的差异。同时采集4例正常股动脉标本（正常组）和4例动脉粥样硬化性股动脉标本（病变组），用免疫印迹法检测HSP70及其磷酸化HSP70（Ser15）、磷酸化HSP70（Ser78）和磷酸化HSP70（Ser82）。对正常组与病变组的蛋白表达水平进行统计学分析。 结果 A组HSP70浓度为（46.731±12.986）ng/mL，ABI为（0.231±0.056）。B组HSP70浓度为（67.104±18.262）ng/mL，ABI为（0.622±0.065）。正常组HSP70蛋白表达及磷酸化水平分别为（0.812±0.131） ng/mL、（0.643±0.107） ng/mL、（0.918±0.206） ng/mL和（0.891±0.168） ng/mL;病變组蛋白表达分别为（0.463±0.072） ng/mL、（0.424±0.081） ng/mL、（0.393±0.065） ng/mL和（0.572±0.101） ng/mL，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 血清HSP70浓度与LEASO严重程度呈负相关，而HSP70浓度与ABI值呈正相关。病变组HSP70含量及其磷酸化水平明显低于正常组，可能与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。

[关键词] 下肢动脉硬化闭塞症;热休克蛋白70;磷酸化;踝肱指数

[中图分类号] R543.5          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2021）07-0062-04

Expression and clinical significance of HSP70 and its phosphorylation in arteriosclerosis obliterans of lower extremities

HUO Xin1   CAO Zhiting2   CAI Xuchao3

1.Department of Vascular Surgery，Liuzhou People′s Hospital in Guangxi Zhuang Autonomous Region， Liuzhou   545005， China; 2.Department of Radiology，Liuzhou People′s Hospital in Guangxi Zhuang Autonomous Region， Liuzhou   545005，China; 3.Department of Vascular Surgery， Hangzhou Geriatric Hospital， Hangzhou   310022， China

[Abstract] Objective To analyze the differences in heat shock protein 70（HSP70）and its phosphorylation levels in patients with lower extremity arteriosclerosis obliterans（LEASO） at different stages， and its clinical significance. Methods Blood samples of 80 patients with lower extremity arteriosclerosis obliterans（LEASO） who were admitted to Liuzhou People′s Hospital from September 2017 to December 2019 were collected and divided into group A （ABI≤0.430） and group B （ABI>0.430） according to the ankle-brachial index （ABI）. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to determine the expression of HSP70 in patients in our hospital at various stages. The differences in HSP70 concentration and ABI between the two groups were analyzed. At the same time， four normal femoral artery specimens（normal group） and four atherosclerotic femoral artery specimens（pathological group） were collected. The HSP70 and its phosphorylated HSP70（Ser15）， phosphorylated HSP70（Ser78） and phosphorylated HSP70 （Ser82） were detected by Western blotting. The protein levels of the normal group and the diseased group were statistically analyzed. Results The concentration of HSP70 in group A was（46.731±12.986）ng/mL， and the ABI was （0.231±0.056）. The concentration of HSP70 in group B was（67.104±18.262）ng/mL， and the ABI was （0.622±0.065）. The protein expression and phosphorylation level of HSP70 in the normal group were （0.812±0.131）ng/mL， （0.643±0.107）ng/mL， （0.918±0.206）ng/mL and （0.891±0.168） ng/mL， respectively. The protein expression and phosphorylation level of HSP70 in the pathological group was（0.463±0.072）ng/mL， （0.424±0.081）ng/mL， （0.393±0.065）ng/mL and（0.572±0.101）ng/mL， there was significant difference between the two groups（P<0.05）. Conclusion Serum HSP70 concentration is negatively correlated with LEASO severity， while HSP70 concentration is positively correlated with ABI value. The HSP70 content and phosphorylation level of the diseased group is significantly lower than that of the normal group，which may be closely related to the occurrence and development of atherosclerosis.

[Key words] Lower extremity arteriosclerosis obliterans; Heat shock protein 70; Phosphorylation; Ankle-brachial index

动脉粥样硬化是导致心、脑、四肢缺血的主要心血管疾病，严重者可导致梗死。动脉粥样硬化已成为威胁人类健康的第一大杀手和世界上人类死亡的主要原因[1]。下肢动脉硬化闭塞症（Lower extremity arteriosclerosis obliterans，LEASO）是一种慢性进行性疾病，其表现为动脉粥样硬化，使下肢动脉内膜增厚，管腔变窄甚至闭塞，进而导致患肢间歇性跛行、静息痛甚至溃疡等一系列症状和体征坏死。动脉粥样硬化，尤其是LEASO，是一个复杂的炎症过程，是冠狀动脉疾病的主要潜在原因。目前对下肢动脉粥样硬化闭塞症发病机制的研究表明，内皮功能障碍是动脉粥样硬化的早期事件，与动脉粥样硬化斑块的发展密切相关[2]。

热休克蛋白（Heat shock protein，HSP）是机体重要的应激保护蛋白，广泛分布于各种组织和细胞中，在受到热、氧化应激或毒物刺激后迅速大量表达。热休克蛋白按分子量可分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子热休克蛋白家族。HSP70是一种磷酸化热休克蛋白，其是热休克蛋白家族的一员[3]，在人冠状动脉中的表达模式与斑块负荷呈负相关。

HSP70的表达在动脉粥样硬化过程中可能降低，正常动脉和动脉粥样硬化斑块的培养表明，HSP70在正常动脉中的含量较高[3]。股动脉闭塞组与正常股动脉造影结果比较，其HSP70表达明显低于正常股动脉硬化组。同时发现复合动脉粥样硬化斑块中HSP70的表达较低，动脉粥样硬化患者血清HSP70水平明显低于健康对照组，提示血清HSP70水平可作为评价动脉粥样硬化严重程度的指标[4]。此外，差异蛋白质组学研究表明，不稳定斑块的HSP70较稳定斑块显著降低，提示HSP70在炎症和氧化应激中起重要作用，这可能与斑块的稳定性有关[5]。较高的HSP70水平可以预测心脏病发作、中风或降低心血管疾病死亡的风险[6]。此外，增加HSP70的含量可以减轻实验性动脉粥样硬化，减轻炎症，降低胆固醇水平，血浆HSP70水平可能是动脉粥样硬化的潜在指标[7]，血清HSP70水平可能是动脉粥样硬化的潜在治疗靶点[8]。然而，目前尚不清楚HSP70及其磷酸化位点在疾病不同阶段的表达差异及其作用。本研究的目的是进一步阐明HSP70在不同类型和不同分期的LEASO患者中的表达差异及其磷酸化。此外，本研究旨在探讨其在LEASO发挥的作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年9月至2019年12月柳州市人民医院80例LEASO患者未经手术治疗的临床资料。LEASO 80例，因病截肢4例，创伤性截肢4例。所有参与者在研究开始前给予知情同意，本研究获得柳州市人民医院医学伦理委员会批准。采集空腹血样。Fontaine分期：Ⅰ期，无症状7例;Ⅱa期，轻度间歇性跛行18例;Ⅱb期，中度至重度间歇性跛行24例;Ⅲ期，缺血性静息27例;Ⅳ期，溃疡及坏疽4例。根据踝肱指数（Ankle brachial index，ABI），将80例患者分为A组（ABI≤0.430）和B组（ABI>0.430），每组各40例。A组男35例，女5例，年龄40～65岁;B组男37例，女3例，年龄41～67岁。8例截肢患者中4例为外伤患者（正常组），4例为动脉粥样硬化患者（病变组）。采集股动脉标本。正常组男3例，女1例，年龄38～65岁，因外伤不能保留患肢;病变组男2例，女2例，年龄43～70岁，均为坏疽，手术治疗无效。

1.2 方法

1.2.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）  从我院快速采集血液样本，并在4℃下保持8～12 h。之后，从血液样本中分离血清，并保存于-20℃下以供进一步研究。采用酶联免疫吸附试剂盒（美国纽约创新诊断公司），根据制造商的方案检测80例LEASO患者血样中HSP70。

1.2.2免疫印迹法  通过添加Sigma从血样中分离总蛋白。蛋白质提取液用SDS-PAGE分离并转染到PVDF膜（微孔膜）上。用5%（w/v）试剂级脱脂乳封闭膜，并用主要抗体[包括HSP70（ab12351）、磷酸化HSP70（Ser15）（CST，2406T）、磷酸化HSP70（Ser78）（CST，2215）和磷酸化HSP70（Ser82）（CST，2435）]在4℃下培养过夜，然后进行二级抗体培养。蛋白质条带用CLARITYTM Western ECL底物（Bio-Rad）显示。

1.3 观察指标

对HSP70浓度与ABI和Fontaine分期进行相关性分析。此外，还对4例正常股动脉标本（正常组）和4例动脉粥样硬化性股动脉标本（病变组）中HSP70和磷酸化HSP70（Ser15）、磷酸化HSP70（Ser78）和磷酸化HSP70（Ser82）的表达进行相关性分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行分析。计数资料以[n（%）] 表示，采用χ2检验，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Fontaine分期与ABI和HSP70浓度的相关性

在80例LEASO患者中，Fontaine分期[1]中Ⅱa期、Ⅱb期、Ⅲ期、Ⅳ期HSP70浓度均与Ⅰ期比较，Fontaine分期越晚，HSP70浓度越低，ABI也同样，均呈负相关。

另外，通过对HSP70浓度与不同ABI的关系分析，发现B组HSP70浓度和ABI均显著高于A组，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 正常組与病变组HSP70蛋白表达及其三个磷酸化位点比较

病变组HSP70蛋白表达水平及磷酸化水平明显低于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

目前关于 LEASO 发生机制的研究表明[9]，内皮功能障碍是发生动脉粥样硬化的早期事件，其与动脉粥样斑块的进展有重要关系。近年来，“内皮损伤反应学说”受到了广泛关注，另一种主要学说是脂质浸润学说。同时研究发现[10]，合并冠状动脉疾病的LEASO比率明显高于其他疾病，高达 70%。HSP是指细胞在应激源特别是环境高温诱导下所生成的一组蛋白质。HSP在生物界中的一个重要特点是其在进化过程中的高度保守性。从大肠杆菌、酵母、果蝇和人体分离的分子量为70 kD的HSP，如果对其进行全氨基酸序列分析，就可发现其具有80%以上的相似性[11]。HSP在进化过程中的高度保守性，说明其具有普遍存在的重要生理功能，而HSP70与动脉硬化闭塞症之间的关系十分密切。

在生理条件下，当细胞处于非应激状态时，HSP70的表达量较低，主要以大分子聚合物的形式存在，一般不活跃，主要作为分子伴侣调节肽的运输、折叠和组装[12]。当细胞受到生物或物理因素的刺激时，HSP70的表达增加，大分子聚合物解聚形成低聚物，主要受HSP70分子磷酸化的调控，HSP70有三个磷酸化位点，包括Ser15、Ser78和Ser82，其中Ser78和Ser82位于C端，Ser15位于N端。最新证据表明，磷酸化的HSP70是一种有效的抗凋亡分子[13]。在高胆固醇饮食诱导的大鼠主动脉粥样硬化模型中，46种蛋白在主动脉组织中表达差异，磷酸化的HSP70水平降低[14]。磷酸化HSP70在正常动脉内膜标本的条件培养基中含量丰富，而在动脉粥样硬化条件培养基中却很少发现。心肌活检显示，动脉粥样硬化患者HSP70的磷酸化水平比正常人低20倍左右[15]。

然而，由于目前尚不清楚HSP70与LEASO不同Fontaine分期的关系。本研究结果显示，LEASO阶段越高，ABI越低，HSP70浓度越低;相反，LEASO阶段越低，ABI越高，HSP70浓度越高。以往对ABI的研究结果一致认为，ABI在LEASO缺血评估中具有重要价值，准确性高[15]。HSP70浓度越高，相应的ABI值越高;HSP70浓度越低，对应的ABI值越低。因此，可以得出HSP70浓度与ABI值呈正相关的结论。此外，ABI的大小反映了LEASO的严重程度，即患者ABI越低，病情越严重，HSP70浓度越低。当HSP70浓度升高时，病情发展缓慢，反之亦然。因此，HSP70可作为评价动脉粥样硬化的生物学指标，表明血清HSP70浓度与LEASO严重程度呈负相关，HSP70浓度与ABI值呈正相关。此外，本研究结果还发现病变组HSP70及其3个磷酸化位点的蛋白表达水平均显著低于正常组（P<0.05）。也就是说，动脉粥样硬化患者股动脉中HSP70的含量及其磷酸化程度明显低于正常人股动脉。目前，关于正常人HSP70及其磷酸化含量的报道很少。本研究测定了血样中HSP70的浓度和蛋白表达，并分析了HSP70浓度与ABI或Fontaine分期的相关性。本研究结果也为进一步研究HSP70在LEASO患者中的作用提供了很好的帮助。

综上所述，血清HSP70浓度与LEASO严重程度呈负相关，而HSP70浓度与ABI值呈正相关。HSP蛋白的大量表达可能与人股动脉硬化的发生、发展密切相关。这将为今后研究LEASO的诊断、发病机制和治疗奠定基础。

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（收稿日期：2020-08-17）