调控植物叶片内在大小的分子机制

张禾，李磊

北京大学 生命科学学院，北京 100871

1 植物器官生长由基因和环境共同调节

植物是地球上分布最广泛的高等生命形态，植物器官大小在不同物种间表现出了巨大的多样性，对器官大小的精确调控是植物在地球上生存繁衍的结构和功能基础[1]。一株种子植物通常可以视为多个相同组分的集合，例如丛生的叶片以及多轮的花器官(萼片、花瓣和心皮等)，这表明发育具有显著的可重复性，能够在个体间不断产生具有相同大小、形状和功能的特定器官[2-3]。一方面，植物器官的最终大小和形状必须依据发育阶段和环境条件进行调节，以便最有效地利用植物的周围环境，例如，叶片捕获阳光以及花器官吸引传粉者等；另一方面，即便在环境达到最优时，器官大小也只在相对稳定的范围内波动，如拟南芥的叶片不会长到睡莲叶片的尺寸[2]。因此，植物器官生长到特定大小是一个由基因进行程序性调控并受到环境调节的过程[4]。

植物器官生长是一种胚后生长方式，主要有两类：一类以叶片为代表，由确定性生长达到最终尺寸的生长模式；另一类以根为代表，以具有无限生长潜力的顶端生长模式进行不确定性生长[5]。通常植物器官发生由分生组织开始，分生组织由一群多能干细胞组成，这些细胞始终保持着自身的未分化状态[6]。当前的研究认为植物有三种分生组织：一是茎分生组织，产生叶片、腋枝、花原基和茎组织；二是根分生组织，维持根的伸长、生长，根分生组织还包括侧根分生组织，产生侧根根系；三是维管分生组织，主要功能是使得运输组织进行精细化分工，在木质植物中形成韧皮部和木质部以及茎的增厚等[7]。简单来说，分生组织通过细胞分裂和细胞扩张产生器官原基，随后器官原基进一步生长分化形成新的植物器官。

2 叶片生长过程

叶片是植物进行光合作用的主要场所，提供植物生长发育所需的物质能量，同时供给人类社会食品、饲料和工业原料[8]。在真双子叶植物中，叶片起始于茎顶端分生组织，分生组织产生叶原基，再由叶原基经过发育长成为成熟叶片。以拟南芥为例，叶原基向成熟叶片的转化通常被定义为两个连续且重叠的阶段。第一阶段，在生长素积累高而细胞分裂素积累低的区域，叶原基从茎顶端分生组织的侧面开始发育，整个叶原基在这一阶段都处在活跃的细胞分裂周期中，由此产生体积相对恒定的子细胞。随着发育的进行，在叶片末端出现了阻滞区，细胞增殖被限制在叶片基部，这一区域的细胞数目会持续增加，直至增殖活动完全停止。远端细胞则在一段时间后退出细胞分裂周期，进入有丝分裂后的扩张阶段，也就是第二阶段。这一时期的生长是通过细胞自身体积的增大并伴随着细胞核内复制的倍性增加而完成的(内复制是指细胞核内发生了多轮基因组复制，但并不发生细胞分裂，从而导致细胞倍性增加的现象)。在第二阶段，叶片细胞分裂停止后，细胞开始快速扩张，与分生组织或叶原基增殖区的细胞相比，此时增大的细胞呈现高度的空泡化，即液泡显著增大，从而导致细胞体积大幅度增加。叶片上细胞增殖和细胞扩张在时间上并不完全分开，因此第一和第二阶段之间的重叠部分也被描述为过渡阶段。此时叶尖部分的细胞首先停止分裂，而更多的叶片基部细胞(包括远端的气孔和原形成层细胞)仍然继续增殖，叶片上增殖区和非增殖区之间的边界迅速出现，而且这一边界与叶基部的距离在相当一段时间内保持恒定。随后，当所有表皮细胞停止增殖后，这一边界就迅速消失。除了以上两个阶段的细胞增殖和细胞扩张的发育调控过程外，叶片中的分生组织通过不对称分裂，形成保卫细胞和气孔。因此，也有研究将叶片生长更细化为五个重叠且关联的过程，即发育起始、一般细胞分裂、过渡阶段、细胞扩张和分生组织分裂。综上，叶片从叶原基开始最终形成了一个扁平的双面结构，并且具有显著的前后极性、背腹极性和中外侧极性[7-11]。

叶片最终大小受到了严格的时空遗传调控。当前模式植物拟南芥的遗传研究为理解叶片发育的复杂过程提供了强有力的工具，是研究真双子叶植物单叶发育的主要模型[12]。最近多项研究揭示了叶片大小的具体调控机制，认为至少有四个主要的细胞发育过程影响了叶片大小：一是叶原基起始的细胞数量；二是叶片细胞增殖的速率和持续时间；三是叶片细胞扩张的速率和持续时间；四是分生组织分裂的程度[11,13-14]。以上过程的改变通常会导致细胞数量或细胞大小的变化，从而影响叶片最终大小。因此，细胞增殖和细胞扩张的精确调控是决定叶片最终大小的关键因素。

3 细胞增殖与细胞扩张作用基因

细胞增殖是指细胞将遗传信息复制后传递给分裂产生的两个子细胞的过程。这一过程由多种细胞周期蛋白及其互作蛋白进行调控(图1)。得益于拟南芥中突变体的研究，目前对于参与叶片增殖的基因有了较为详细的了解[14]。叶原基发育起始于生长素浓度高的区域，而叶片发育调控持续受到植物激素的作用。植物特异的小蛋白ARGOS受生长素诱导而表达，而ARGOS蛋白定位在内质网上，能够刺激DNA结合蛋白ANT(ANTEGUMENTA)的表达，ANT又能促进细胞周期相关基因的表达，并最终促进细胞增殖。当ANT和ARGOS突变后，细胞增殖停止提前，细胞数目减少，叶片减小，而且ANT的活性受到auxin response factor family(ARFs)的抑制，从而参与到生长素信号调控网络中[15]。

图1 拟南芥叶片大小作用因子。叶片的最终大小主要取决于细胞增殖和细胞扩张，这两个生长阶段都受到多种基因编码的作用因子调控(图中，叶片基部标注的基因主要在细胞增殖中起作用，叶尖部分标注的为细胞扩张作用因子，用黑色字体表示，箭头为促进作用，T形符号为抑制作用。ANT，ANTEGUMENTA；ARFs，auxin response factors；Class Ⅰ TCP，Ⅰ类TCP，TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/PCF；BB，BIG BROTHER；GRFs，growth-regulating factors；GIF，GRF interacting factors；ABP1，AUXIN BINDING PROTEIN 1；ARL，ARGOS-LIKE；AN，ANGUSTIFOLIA；ROT3，ROTUNDIFOLIA 3；TOR，target of rapamycin)

另一类重要的调控通路涉及TCP(TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/PCF)转录因子家族。TCP隶属于b-HLH转录因子(basic helix-loophelix-type transcription factors)家族，在分蘖、叶片增殖、花器官发育中均起重要的调控作用。TCP结构域是一种植物特异的DNA结合基序，能够特异性地结合到被称作“site Ⅱ elements”的顺式元件上。目前研究发现拟南芥中共有24个TCP家族成员，根据DNA结合域的结构分为Ⅰ类TCP(包括13个成员)和Ⅱ类TCP(包含11个成员)两个类别。Ⅰ类TCP对细胞增殖的促进作用依赖于特异的时空表达模式[15-17]；Ⅱ类TCP也被称为CINTCPs(CINCINNATA-like TCPs)，它通过促进细胞分化，能够及时阻止叶片增殖，让叶片顺利进入下一阶段的发育进程中，是细胞分裂过渡到细胞扩张的重要调控因子[15]。例如：TCP4通过抑制细胞分裂素的作用间接限制细胞的增殖生长[9,18-19]；TCP14和TCP15能够与酶蛋白SPY进行互作，共同促进叶片和花中细胞分裂素响应[16,20]，而且TCP14和TCP15的稳定性受到另一种泛素结合蛋白DA1的调节。DA1能够使TCP14、TCP15以及TCP22失活，同时DA1还与E3泛素连接酶DA2协同作用。在da1-1和da2-1突变体中，由于细胞增殖时间延长，叶片相较于野生型更大，而DA1又能被E3连接酶BB(BIG BROTHER)激活，进一步调节细胞增殖生长期[21-23]。与CIN-TCPs相对的是，GRF(GROWTH-REGULATING FACTOR)转录因子及其作用因子GIF(GRF-INTERACTING FACTOR)则通过维持细胞增殖周期来正向调控叶片大小[24]。

与细胞增殖相比，对于细胞扩张的调控基因的了解相对较少(图1)。这是因为：一方面，细胞扩张的机制更为复杂，例如介导生长素信号转导的ABP1(AUXIN BINDING PROTEIN 1)基因，在发生异位表达后导致细胞增大，但同时细胞数量发生代偿性减少，因此整个器官的大小并没有变化；另一方面，器官发育具有极性，如拟南芥an(angustifolia)突变体由于在叶宽方向上细胞扩张的特定缺陷而具有更窄更厚的叶片。相对地，rot3(rotundifolia 3)突变体具有更宽的叶片和花器官是因为在叶长轴方向存在细胞扩张缺陷[25-27]。此外，还有研究报道了拟南芥ARGOS基因的同源基因ARL(ARGOS-LIKE)低表达或过表达时分别导致较小或较大的叶片。这些变化主要是由于ARL促进细胞扩张进而促进器官生长[25]。过表达由TOR(TARGET OF RAPAMYCIN)基因编码的激酶也会导致细胞变大，产生更大的叶片[2,28]。

4 植物细胞壁组分与功能

细胞扩张的具体机制依赖于植物独特的结构。与动物细胞不同，植物细胞被一层柔韧的细胞外基质即细胞壁所包围，而细胞壁也是植物能够成为地球上最广泛的高等生命形态的原因之一。细胞壁的隔离能够使得植物细胞不受环境因素(如阳光、空气、水和矿物质营养等)的直接作用[29-31]，并且抵抗病原体入侵，充当了细胞损伤的防护屏障，保护植物细胞免受各种环境和生物胁迫的侵害[32]。细胞壁位于细胞质膜和中胶层之间(厚度为0.1～1 μm)，是一种处在动态变化中的复杂网络结构，由相互作用的多糖、蛋白质、多酚、小分子和水组成。细胞壁将植物细胞彼此黏附，从而在生长过程中将这些细胞的相对位置锁定在适当的地方以支持植物生长。细胞壁在细胞外侧形成一个强大的网络，压缩了内部的原生质体，由此可认为植物细胞的生长由内部膨压和细胞壁延展性之间的平衡所决定[3,33]。在生长过程中，细胞体积有时会发生巨大变化，甚至达到几个数量级的差别，因此细胞壁需要以高度受控的方式来松动，以便在体积变化时不对细胞造成损伤[34]。总之，细胞壁充当了原生质体与细胞外环境之间的接口，为植物细胞提供感知外部变化的结构基础，在生长发育过程中决定发育形态和机械特性[35-37]。

细胞壁主要分为三种主要类型：第一类是在活跃生长的植物细胞上沉积而形成的初生细胞壁，主要包含多糖(纤维素、半纤维素及果胶)和蛋白质；第二类是次生细胞壁，存在于特定分化的细胞类型中，主要成分为多糖(纤维素、半纤维素等)和木质素；第三类为中胶层，主要成分为果胶，中胶层直接来源于细胞胞质分裂过程中产生的细胞板[38-39]。细胞生长过程中初生细胞壁沉积在中胶层上。通常在所有细胞类型中都存在初生细胞壁和中胶层，但只有在某些特定类型细胞停止生长后，初生细胞壁上才会沉积次生细胞壁[29]。

三种类型的细胞壁具有不同的化学性质、物理性质及生物学功能。尽管初生细胞壁和次生细胞壁都直接充当了细胞的机械外壳，能够抵抗从内到外的膨胀压力和从外到内的压缩力，但只有初生细胞壁能够响应施力后产生的延伸变形，从而确定细胞生长的方向和速率。因此，研究人员普遍认为是初生细胞壁决定了细胞生长的速率和方向[39-40]。除了以上的机械作用外，初生细胞壁还是细胞间信息交流处理系统的一部分[41]。

初生细胞壁中三种主要多糖成分的占比分别为：纤维素占30%，半纤维素占30%，果胶占35%[42]。纤维素是初生细胞壁的主要机械成分，具有与钢相近的抗拉强度。它由多个β-1,4-葡聚糖链组成，这些葡聚糖链通过氢键结合在一起形成电缆状的纤维素微纤维，构成细胞壁骨架[35,43-44]。最新的模型认为纤维素微纤维是初生细胞壁的主要承重成分，由纤维素合成酶复合物合成，在高尔基体中组装后输送到质膜上[45-47]。有报道显示，拟南芥纤维素酶缺陷突变体中纤维素含量降低，叶片和子叶面积显著减少[48]。

半纤维素是存在于所有陆地植物中的一种多糖链，包括木葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖和葡甘露聚糖[49]。木葡聚糖是主要的半纤维素，其分支结构包括β-1,4-葡聚糖主链和侧链，侧链组有木糖、半乳糖和岩藻糖残基[50]。鉴于半纤维素的结构、生化特性和细胞分布的多样性，有越来越多的酶及代谢途径被认为参与到了半纤维素的生物合成中[51-53]。研究发现，半纤维素通过充当纤维素微纤维之间的黏合层影响细胞壁力学特征，增强细胞壁强度，并在生长过程中控制微纤维在外力作用下的运动[54-57]。研究发现，过表达木葡聚糖水解酶会导致叶片面积增大[58]。

果胶是一类与其他细胞壁基质多糖不同的独特成分，具有大量半乳糖醛酸形式的酸性糖和少量的葡萄糖醛酸[59-61]。果胶的生物合成也从高尔基体开始，高尔基体是多室细胞器和细胞壁多糖的“工厂”。果胶是决定细胞壁生物物理性质的主要因素，如黏附力、内聚力和延展性。越来越多的研究证明，果胶对细胞生长和组织形态发挥着关键作用，而这些作用在之前的研究中未受到重视[60,62]。例如，利用固态核磁共振波谱分析发现，细胞壁中纤维素-果胶的作用更为广泛，而纤维素-木葡聚糖的连接却比先前设想的要少[63]。目前，研究者已鉴定出三种主要类型的果胶多糖，即高半乳糖醛酸(HG)、鼠李糖醛酸Ⅰ(RG-I)和鼠李糖醛酸Ⅱ(RG-Ⅱ)。其中，HG是主要形式，约占所有细胞壁果胶的2/3[64]。HG的化学结构为α-1,4糖苷键连接的半乳糖醛酸线性链[59,61]。半乳糖醛酸亚基可进行化学修饰，在O2和O3位置上乙酰化，在C6位置上甲酯化[65-66]。RG-I的主链由交替的半乳糖醛酸和鼠李糖残基组成，并锚定阿拉伯糖、半乳糖和阿拉伯半乳聚糖侧链。RG-Ⅱ是一种高度保守的复杂果胶，其主链与HG相同，侧链含有13种不同的糖基和20多种不同的糖基键[38]。研究表明，HG、RG-I和RG-II之间通过共价键连接[67]。果胶及其组分的生物合成过程十分复杂，至少需要67种不同类型的酶参与[68]。据报道，在拟南芥基因组中有730多个基因编码了可能的糖基转移酶或糖基水解酶[69]。有研究将高尔基体分离出体外进行蛋白质组学分析，以此来确定可能参与到果胶多糖生物合成中的酶等蛋白质[65]。然而，由于这些酶大多是具有活性形式的完整膜蛋白，使用酶解或者酸碱破坏共价键等方法逐步降低果胶结构复杂度，也使得这些研究当中丢失了很多重要的信息。这些因素加上缺乏可靠的体内实验技术手段，导致分离和跟踪单个特定基因非常困难。因此，果胶生物合成相关基因的生物学功能和遗传调控作用，在很大程度上仍然是未知的[70]。

5 植物miRNA调控生长发育

MicroRNA(miRNA)是一类长度为20～24个核苷酸且具有调控作用的内源非编码RNA，主要在转录后调控基因表达。它们存在于藻类和植物等绝大多数的真核生物当中，在基因调控中起着重要作用[71-72]。miRNA先由细胞核内MIR基因转录形成较长的单链RNA，称为miRNA初级转录本(primary transcripts, pri-miRNAs)；随后pri-miRNA通过剪切折叠等过程形成具有茎环结构的miRNA前体(miRNA precursor, premiRNA)；pre-miRNA再次剪切形成miRNA双链结构。双链打开后形成两条RNA单链，其中负义链称为miRNA*，随后被降解，正义链则为成熟的miRNA。在动物和植物中，miRNA的形成过程有所差异，包括介导剪切的酶也不同。在动物中，对miRNA初级转录本进行切割的酶是Drosha，形成的miRNA前体从细胞核被运到细胞质中，再由Dicer进行第二步的剪切[73]；而在高等植物中，miRNA的两步剪切都是在细胞核内进行的，主要是由DCL1(Dicer like 1)进行剪切。剪切后的双链结构再运送到细胞质中，形成成熟的miRNA，通过和AGO蛋白的结合，产生RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)[74]，最终完成对目标mRNA的剪切或翻译抑制，从而沉默靶基因[75]。

miRNA通过与靶基因碱基互补配对而发挥功能。在动物细胞当中，miRNA与靶基因的配对区域通常限制在miRNA的3＇端的种子区，只结合而不剪切，miRNA形成的沉默复合体打破了靶基因mRNA合成的平衡从而抑制基因表达[76]。植物当中miRNA起作用的方式则主要通过miRNA与具有切割功能的蛋白组成的沉默复合体RISC对靶基因的mRNA进行剪切。miRNA发挥作用时与靶基因的碱基配对程度较为灵活，这就决定了它们调控靶基因数量和种类的多样性。目前在植物当中已经被实验证实的miRNA靶基因约有几百个，但结合多种生物信息学预测工具所得出的数据综合分析，仅仅拟南芥中约300个miRNA就对应了约5 000个靶基因，说明仍然存在很多潜在的miRNA与靶基因的作用方式[77]。

目前对miRNA及其靶基因调节发育过程的认知，集中体现在植物生长多细胞互作方面，例如生长素信号转导、分生组织的边界形成和器官分离、叶片的发育和极性形成、侧根的形成、从幼年到成年的营养生长期与开花生殖期的转换、花器官特征和繁殖等[78-81]。有趣的是，有些miRNA不单独行使功能，而通过相互重叠的调节网络来发挥作用[82-83]。

叶片的生长发育涉及多个相互协调的miRNA(图2)。在叶片形成初期，需要建立分生组织细胞、未分化细胞和具有分化潜能细胞之间的界限。器官边界的调控因子CUC1、CUC2(CUPSHAPED COTYLEDON1/2)被证实受miR164调控。过表达miR164影响器官的正常分离，导致子叶、叶片及花序茎和茎生叶发生异常融合；而破坏miR164及其靶基因之间的互作，则会导致叶片叶序和叶片形状的异常[78,84]。在叶片发育后期，miR319对靶基因TCP家族的调控是细胞增殖和细胞扩张中的重要调控环节。研究发现，过表达miR319及TCP基因功能缺失的多重突变体中一致产生叶片增大、叶边缘卷曲等表型[72]。然而，通过突变TCP4与miR319的结合位点获得的TCP4过表达植株，则显示出叶片缩小的表型。如前所述，TCP4又是调控细胞周期蛋白的重要转录因子[9,83]，因此miR319通过影响细胞周期而调控叶片发育，而且miR319也与调控叶片形态发生的miR164-CUC通路相关联[83]。同时，CIN-TCPs还可以反过来促进miR396的表达，而miR396靶向编码GRF转录因子家族的基因。GRF及GIF一同维持细胞分裂，因此在grf及gif缺陷突变体中叶片更小更窄(图2)[85]。

图2 叶片生长miRNA调控通路。叶片的大小发育受到多个miRNA的调控。叶原基到发育早期叶片，miR164 靶向边界调控因子CUC1、CUC2；在叶片发育后期，miR319调控TCP4参与到细胞增殖与细胞扩张过程。CIN-TCPs促进miR396表达，miR396调控GFR(图中，miRNA及蛋白作用因子用黑色字体表示，箭头为促进作用，T形符号为抑制作用。CUC1/2，CUP-SHAPED COTYLEDON1/2；TCP4，TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/PCF 4；GRF，growthregulating factors)

miRNA除了对细胞增殖周期基因的直接作用外，还可以通过靶向细胞壁多糖基因来对叶片大小进行调控。最近研究者在拟南芥中鉴定了23个预测靶向细胞壁多糖合成基因的miRNA，并将其命名为细胞壁miRNA(CW-miRNA)。以miR775的功能特性为例，研究发现miR775能够靶向一种编码糖基转移酶31家族的半乳糖基转移酶基因GALT9。过表达miR775会产生更大的叶片，敲除GALT9也得到同样的表型。研究者通过对miR775过表达材料及靶基因敲除材料中大叶片的细胞学分析，发现这些叶片中细胞大小显著增大但细胞增殖未发生显著变化。进一步分析发现，这些增大细胞的细胞壁中果胶含量显著下降。研究者利用原子力显微镜技术发现，果胶的下降伴随了细胞壁弹性模量的显著降低。以上结果证明，miR775-GALT9通路通过调控细胞壁上果胶水平和细胞壁弹性模量来控制单个细胞大小并进而调控器官大小(图3)[86]。

图3 MIR775A-GALT9 通路调控叶片内在大小。miR775抑制GALT9的表达，细胞壁上果胶含量下降，细胞壁刚性降低，叶片细胞增大从而导致叶片更大。从左到右为miR775与靶基因互作、初生细胞壁结构示意图(橘黄色柱体为纤维素，蓝色曲线为果胶，绿色曲线为半纤维素)及植物叶片

6 展望

在细胞水平，细胞分裂和细胞扩张这两个过程是确定叶片最终大小的决定因素。尽管当前人们在了解叶片最终大小的调控机制方面已经取得了巨大进展，但一些重要的问题只得到部分回答，而其中一些关键问题将会是未来研究的热门领域。一个关键问题是细胞在分裂或扩张过程中如何主动监控自身大小的。细胞内外的协调作用共同决定了细胞命运和器官建成，这其中需要准确的时空调控和信号交流。既然细胞分裂和细胞扩张的过程都涉及细胞壁的动态变化，那么细胞壁是否参与监控细胞大小呢？外部细胞壁又是如何感知细胞内部进程的变化而改变自身的组分和理化性质的？细胞壁作为一种超级复杂的结构，据估计植物将高达约10%的基因投入到细胞壁的生物合成和调控中[57]，这些基因在生长发育过程的不同时期使得细胞壁发生特定的变化。miRNA调控正是植物体内一种灵活高效的调控方式，植物生长发育及器官的生长都受到miRNA网络的广泛控制。同时，这些miRNA调控网络也受到转录因子的级联调控，而miRNA又能反过来作用在转录因子和功能基因上，这一反馈调控方式使得miRNA能够更好地调控生长发育进程。

鉴于细胞壁多糖的复杂性，对其生物合成的化学基础和调控模式仍然需要更深入的研究。未来利用多种实验和计算技术分离目标蛋白、开发酶分析方法以及构建多组学调控网络来建立分子和物理模型都是至关重要的研究方向。