中性粒细胞胞外诱捕网在痛风性关节炎中的作用：一枚硬币的两面＊

王雪霖，曹秀梅，闫建设†

①上海大学 生命科学学院，上海 200444；②上海交通大学 医学院，上海市免疫学研究所，上海 200025

痛风性关节炎(gouty arthritis, GA)是由单钠尿酸盐(monosodium urate, MSU)晶体沉积引发的炎症性疾病[1]。当痛风性关节炎患者的尿酸浓度超过尿酸的溶解度达到过饱和状态时，MSU晶体会在软骨、滑膜及周围组织沉积并刺激关节滑膜，发生一系列病理反应，从而引发关节处出现急性炎症[2]。此时，血管内皮表面的黏附分子会捕获循环血中的中性粒细胞，渗出血管，定向迁移至关节腔的炎症部位，识别并对抗入侵宿主体内的病原体，发挥保护作用[3]。近年研究发现，除了吞噬及脱颗粒作用外，中性粒细胞也可以通过形成中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)的方式消灭入侵的病原微生物[4]。NETs由于吞噬刺激从中性粒细胞释放的胞外DNA纤维，帮助嗜中性粒细胞固定并诱捕细菌、真菌或病毒，从而更有效地消除这些病原体[5]。Brinkmann等人[6]率先发现NETs，他们通过免疫荧光及DNA染料染色的方法对NETs的组成进行分析后得出，该结构是由染色质和蛋白颗粒组成的、能捕获并杀死微生物的胞外网状结构。MSU晶体诱发中性粒细胞NETs产生，后者反过来吞噬捕获MSU晶体，并通过镶嵌在NETs上的弹性蛋白酶、髓过氧化物酶、组织蛋白酶G等酶类的杀菌作用，发挥其抗菌作用，防止炎症扩散[7]。

鉴于中性粒细胞NETs在GA中发挥的重要作用，本文将对GA的发生、发展及炎症消散过程进行概述，重点讨论中性粒细胞NETs在GA中所起到的双重作用，并对GA中参与中性粒细胞NETs形成的相关信号通路进行简述。

1 痛风性关节炎

1.1 痛风性关节炎发生及自我缓解

痛风性关节炎疾病发作过程主要包括急性炎症反应和炎症自行消散两个阶段。痛风是由关节内和关节周围沉积的MSU晶体引发的、具有典型急性炎症特征的疾病，主要表现为严重的关节疼痛、肿胀、红斑和功能丧失。当血尿酸浓度超过正常阈值(成年男性237.9～356.9 μmol/L，女性178.4～297.4 μmol/L)时，机体会形成高尿酸血症。部分患者体内过量的尿酸以晶体形式析出并沉积于关节滑膜、软骨以及周围其他组织，引发一系列炎症反应，进而诱发GA。GA的一个显著特征是其具有“自限性”，患者即使未经治疗，且在其炎性部位仍然可以检测到MSU的情况下，其症状亦可在7至10天内得到缓解。在关节处沉积的MSU晶体破坏了机体正常稳态平衡，引发炎症反应。机体为维持原有稳态会调动自身免疫应答机制，包括中性粒细胞产生NETs对晶体进行包埋，暂时性抑制炎症扩散[8]。

1.2 痛风性关节炎相关病理机制

痛风性关节炎患者滑液和关节周围的MSU晶体被先天免疫系统识别为异物，引发机体免疫反应。MSU晶体激活单核巨噬细胞中Toll样受体(TLR)和NALP3炎性小体的功能[9]，随后活化半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)。后者将已经存在于细胞中的白介素-1β(IL-1β)的无活性前体和白介素-8(IL-8)转化为有活性的成熟细胞因子，并迅速释放至胞外[2]。研究表明，IL-1β和IL-8激活一些促炎相关信号转导通路，包括NF-κB和MAPK通路。其中，NF-κB不仅能够影响促炎细胞因子(比如IL-1、IL-18)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和其他炎性介质的转录，还会影响粒细胞趋化因子(IL-8)的转录[10]。促炎因子和细胞趋化因子的大量产生，导致中性粒细胞浸润加剧[1]，产生痛风发病中的炎症放大效应(图1)。

图1 痛风性关节炎发病过程

痛风性关节炎自限性的形成机制存在多种假说。有研究指出，痛风性关节炎发作早期，肥大细胞(mast cell, MC)与巨噬细胞早于中性粒细胞活化，并释放前列腺素、组胺等多种细胞因子和趋化因子刺激腺体分泌、增加毛细血管通透性，利于中性粒细胞通过毛细血管壁迁移至炎症部位。当大量中性粒细胞在关节处聚集时，可通过释放胞外诱捕网对晶体进行吞噬包埋，减缓炎症进程，使得炎症暂时消散[11]。还有研究指出，在痛风性炎症反应中发挥关键作用的NLRP3炎症小体活化需要上游胞质蛋白、下游caspase-1前体以及衔接蛋白ASC激活，一些胞内炎症小体调节剂(如COPs、POPs等)可通过调节NLRP3炎症小体活性，竞争性结合衔接蛋白ASC，阻断成熟IL-1β释放，抑制炎症反应发生[12]。此外，也有研究指出，内源性IL-1受体拮抗剂(interleukin-1 receptor antagonist, IL-1Ra)通过竞争IL-1受体，阻断由MSU晶体刺激免疫细胞释放的IL-1促炎活性，抑制炎症反应[8]。痛风性关节炎中炎症消散能够抑制辐射性炎症发生，是机体为维持内环境稳态所进行的自我调节过程。

2 中性粒细胞NETs在痛风性关节炎中的双重作用

2.1 中性粒细胞NETs促进痛风性关节炎的炎症反应

在痛风性关节炎中，MSU晶体刺激产生的大量IL-1β在与中性粒细胞及巨噬细胞受体结合之后，对接头蛋白MyD88进行激活。Liu-Bryan等人[13]的研究表明，单核细胞中表达的TLR- 2、TLR-4和它们共享的接头蛋白MyD88是促进中性粒细胞活化、启动机体免疫反应主要的决定因素之一。MyD88蛋白的激活引发核转录因子NF-κB活化，NF-κB又能引发与炎症免疫反应中密切相关的炎症因子(如IL-8、TNF-α)以及一些刺激炎症反应产生的酶(如环氧合酶-2(COX-2)、磷脂酶等)表达，诱使众多中性粒细胞浸润至关节处使炎症反应加剧[14]。中性粒细胞被大量募集至关节处时，通过产生NETs这一胞外网状结构发挥其功能。痛风性关节炎中MSU晶体在组织和关节处沉积是引发炎症部位NETs形成的主要原因。中性粒细胞在对MSU晶体摄取的同时，粒细胞和单核细胞会释放更多促炎细胞因子和趋化因子，从而促进炎症反应[15]。

2.2 中性粒细胞NETs抑制痛风性关节炎的炎症反应

Mitroulis等人[16]的研究首次发现中性粒细胞NETs在痛风性关节炎的炎症消散中具有重要作用。随后他们发现在使用IL-1抑制剂处理后，中性粒细胞形成NETs的能力会明显下降，表明NETs形成过程与IL-1的激活有密切关系[17]。此外，中性粒细胞对MSU晶体的摄取导致自身释放大量细胞因子，包括炎症介质(如TNF-α和IL-6)、中性粒细胞引诱剂(如IL-8)和激活剂(如CCL3和CXCL10)，引发NETs大量形成聚集型NET(aggregated NET, aggNET)。aggNET通过降解细胞因子和趋化因子并破坏嗜中性粒细胞的募集和活化，促进痛风性关节炎的炎症消退[18]。由此可见，NETs形成在痛风性关节炎的炎症消散中起着至关重要的作用。

痛风性关节炎发展至晚期，会在关节等处出现痛风石。痛风石会逐渐浸入到骨质中，这是痛风性关节炎患者关节处出现骨破坏的主要原因[19]。研究表明，痛风石的组成成分和NETs十分相似。在显微镜下观察，痛风石表现为慢性肉芽肿性损害，主要包括由致密结缔组织围绕尿酸单钠化合物晶体为核心所形成的单核/多核巨噬细胞集合物[20]。当发炎部位出现中性粒细胞密度很高的情况时，NETs形成的聚集体aggNET会密集地包裹MSU晶体，通过自身所含蛋白酶捕获并降解一些促炎介质。Chatfield等人[21]的研究表明NETs在痛风的急性炎症以及未发炎的痛风石周围都存在，且其对DNase具有一定抗性，因而在组织中它可通过由DNA包覆的聚集体将晶体隔离，并对发生的炎症反应进行抑制。研究发现，痛风石中同时存在抗炎因子如转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)和促炎因子例如IL-1的表达，导致痛风性关节炎中存在慢性炎症周期，症状为不断反复发作和自我缓解[22]。

由此可见，在痛风性关节炎中中性粒细胞NETs的形成具有双重作用：一方面，NETs形成过多造成聚集后，就易形成痛风石造成骨质侵蚀并诱发机体的慢性炎症反应；另一方面，NETs能够对MSU晶体进行包埋和清理，保护机体。

3 调控痛风性关节炎中NETs形成的相关信号通路

在痛风性关节炎中，MSU 晶体在关节组织处沉积会引起关节处的免疫细胞释放一些促炎性的细胞因子和趋化因子(如IL-1β、TNF-α、IL-8等)，进而诱导大量的中性粒细胞浸润至关节腔，刺激中性粒细胞激活，引发严重的炎症反应。近年的研究表明，痛风性关节炎发病机制受许多因素，例如一些信号通路(ERK1/2、p38 MAPK)、信号传导(炎性细胞因子及Src家族PTK)等影响。MSU晶体通过Src家族的PTK信号传导，诱导单核巨嗜细胞中IL-8启动子的活化和IL-8的表达[23]。在IL-8、IL-1β等炎性细胞因子的作用下，中性粒细胞大量募集，促进炎症反应的进程。此外，MSU晶体也诱使补体激活，通过产生具有趋化作用的C5a促进中性粒细胞浸润，从而影响痛风性炎症反应[24]。大量研究显示，中性粒细胞浸润到关节腔所产生的炎症反应是痛风性关节炎病理机制的核心，下文就IL-8和IL-1β对中性粒细胞趋化性及NETs形成的影响进行讨论。

3.1 IL-1β信号通路

痛风性关节炎发病机制较为复杂，有许多与中性粒细胞NETs形成相关的炎性细胞因子及信号通路参与调控。研究表明，IL-1β信号通路对痛风性关节炎中NETs的形成具有重要作用。IL-1β具有多种功能，它是炎性反应的重要介质，主要由单核巨噬细胞产生，参与多种细胞活动，包括细胞增殖、分化和凋亡等生理活动[17]。IL-1β产生至少受到两个不同步骤的严格控制：首先，IL-1β蛋白前体的产生，当MSU晶体作为一种异物被细胞表面和胞质模式识别受体(TLR2、TLR4、CD14等分子)识别后，引发巨噬细胞内IL-1β转录启动子的激活，促进IL-1β前体生成[25]；随后，对IL-1β前体进行切割以产生具有活性的IL-1β蛋白，对IL-1β前体的加工涉及到上游信号caspase-1的激活，有活性的caspase-1能够对其加工剪切[9]。caspase-1的激活需要上游NALP3炎性体激活，在痛风性关节炎中通过沉积的MSU晶体对NALP3炎性体激活，从而诱导IL-1β释放(图2)[25]。NLRP3广泛表达于树突细胞、单核细胞和巨噬细胞，具有识别病原体的功能。ASC是NLRP3炎性体中的衔接蛋白，将NLRP3炎性小体和caspase-1前体联系起来，形成具有酶活性的异二聚体caspase-1。活化的炎性体效应蛋白caspase-1，将无活性的IL-18和IL-1β前体剪切为成熟的IL-18和IL-1β并释放到细胞外。IL-1β与滑膜细胞、成纤维细胞、内皮细胞等细胞表面的IL-1β受体相互识别，激活接头蛋白MyD88，使NF-κB功能激活，引发炎性细胞因子基因表达，产生包括IL-1、IL-6、TNF-α和中性粒细胞的趋化因子等，促使中性粒细胞进入晶体沉积部位发挥免疫功能，并形成胞外诱捕网吞噬MSU晶体[26]。

图2 MSU结晶诱导IL-1β及IL-8表达信号转导通路[25]

3.2 IL-8信号通路

IL-8是CXC趋化因子家族的成员，是中性粒细胞趋化因子之一，可由单核细胞、巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞和气道平滑肌细胞分泌[27]。在痛风性关节炎中，大量中性粒细胞聚集在关节处形成NETs参与炎症反应是导致发病的因素之一。体外MSU晶体诱导的单核细胞模型中，中性粒细胞大部分趋化活性来自IL-8[28]。IL-8通过促进中性粒细胞趋化，从而影响中性粒细胞在关节处的募集，影响痛风性关节炎的炎症反应进程。在MSU晶体刺激下，Src家族酪氨酸激酶信号传导通过刺激IKK/IκB信号通路，引发NF-κB活化诱导IL-8的表达(图2)[23]。此外，IL-8在激活嗜中性粒细胞后，引起基质金属蛋白酶(matrix metalloprotein, MMP)家族MMP-9和MMP-2从滑膜组织迅速释放，两者可在病理条件下分解与组织破坏相关的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)，进一步加重关节处的炎症反应[29]。由此可见，IL-8在MSU晶体诱导的痛风性关节炎中发挥关键作用，因而抑制IL-8的释放可能为治疗该疾病提供一种新的思路。

4 小结

痛风性关节炎是由关节内和关节周围结晶的MSU晶体引发，进而形成具有典型特征的急性炎症。中性粒细胞NETs作为不同于坏死和凋亡的一种新型细胞死亡方式，在痛风性关节炎的免疫反应中发挥着重要作用。一方面，机体在受到MSU晶体刺激时，引发中性粒细胞在关节处大量浸润，释放NETs结构并促进炎症因子分泌，进一步推动炎症反应进程；另一方面，NETs形成有利于机体对MSU晶体的清除和炎症消除，暂时抑制炎症反应进程。因此，中性粒细胞NETs的形成是一把“双刃剑”，如果形成过多而未及时清除，这种富含各种蛋白水解酶和核酸结构的胶质网状结构能够直接引起关节处的组织损伤，同时也可诱发无菌性炎症反应的发生。此外，痛风性关节炎中炎症反应的强弱、持续时间及性质受到体内各个免疫环节严密调控，合理地平衡体内产生和清除NETs的能力对促进关节处炎症的自行消散过程是十分有益的。机体内的促炎过程与抗炎过程之间既相互联系又相互制约[30]，因此要合理研发既能促进自行消散又能防止炎症进一步扩大的药物，这为今后痛风性关节炎的临床治疗提供一个新的思路。