草莓乙烯响应因子FaERF003基因克隆与表达模式分析

郑珍珍，黄 芸

(北京农学院 植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室, 北京 102206)

目前，乙烯调控果实成熟的研究主要集中在呼吸跃变型果实[1]，而在调控非呼吸跃变型果实成熟中的功能和机制尚不清楚。有报道用乙烯作用抑制剂1-甲基环丙烯(1-MCP)或乙烯利处理影响草莓果实成熟[2-3]。

乙烯响应因子(ethylene response factor, ERF)属于AP2/ERF(APETALA2/Ethylene-Responsive Factor)转录因子超家族，是植物最大的转录因子超家族之一[4]，广泛参与植株生长发育、果实发育和成熟、种子萌发等过程[5]。ERF亚族的蛋白至少含有1个行使DNA结合功能的AP2结构域，该结构域包含60～70个氨基酸残基，由3个β折叠和1个α螺旋构成[6]。

ERF转录因子参与乙烯调控果实成熟的信号转导过程。有研究表明苹果ERF017氨基酸突变影响果实成熟时叶绿素的降解过程[7]，草莓FaERF009可以通过激活呋喃酮氧化还原酶表达调控草莓芳香物质的合成[8]。转录组测序发现猕猴桃ERF003可能调控果实软化[9]，杏ERF003可能调控果实成熟过程中类胡萝卜素的形成[10]。

草莓属于蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)，由于其基因组较小，测序清楚，世代时间短，是研究果实成熟机制理想材料[11]。目前的研究发现草莓的果实发育时期主要受生长素和赤霉素调控，果实成熟主要受脱落酸(ABA)调控，乙烯是否调控草莓果实成熟及其中的机制问题亟待解决。就此通过分子生物学、生物信息学等方法初步探究FaERF003在草莓果实成熟调控中的作用，为进一步研究其生理功能，揭示乙烯调控非呼吸跃变型果实成熟机制的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

植物材料是北京农学院温室栽培的草莓(Fragaria×ananassa)品种‘红颜’。栽培条件为：温度17～26 ℃、相对湿度为60%～80%、光照14 h/黑暗10 h。选择生长状态良好的草莓进行取样。将草莓发育分为七个时期：小绿期、大绿期、褪绿期、白果期、始红期、片红期和全红期。

RNA提取试剂盒购自OMEGA公司、反转录试剂盒购自全式金公司、凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；核酸内切酶、Q5高保真聚合酶购自NEB公司，无缝克隆试剂盒购自诺唯赞公司。所用引物均由北京生工生物有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 RNA提取及反转录 每个时期果实选取3个大小一致的果实样本为一个生物学重复，去瘦果(种子)，切成0.5～0.8 cm3的小立方体，液氮速冻，在冷冻状态下研磨样品。RNA提取与反转录cDNA参照相关试剂盒说明书。

1.2.2 荧光定量 实时荧光定量(qRT-PCR)检测基因相对表达量，反应体系参照Trans-Start Top Green qPCR Super Mix 试剂盒说明，PCR反应程序为：95 ℃，10 min；95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；循环45次。草莓FaERF003基因和内参基因Actin[18]荧光定量引物如下：FaERF003-F: 5′ CCTCCTCCAGAAGTTCAGCG 3′，FaERF003-R: 5′ CATTTGCCCCAATGCCTCTG 3′；FaActin-F: 5′ GGCCAACCGTGAGAAGATG 3′，FaActin-R: 5′GTCCAGAGTCAAGAACAG3′。表达量检测使用实时荧光定量PCR仪，上机结束后，分析试验数据，试验重复3次。

1.2.3 ACC含量测量 精确称取研磨好的样品100 mg，加入氧化锆珠，加入1 mL提取液(乙腈∶水=1∶1)，加入少量抗氧化剂，冰上提取4 h，4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min，取上清。之后分别用甲醇和氨水活化小柱，样品经过浓缩后，加入氨水溶液定容至2 mL后过小柱。用氨水溶液、氨水和甲醇溶液淋洗。加入0.2 mL甲醇溶解，上机进行质谱检测，重复3次。

1.2.4 转录组测序分析 取大绿果期、白果期、始红期和片红期果实，去除瘦果，切成0.5～0.8 cm3的小立方体，液氮速冻，在冷冻状态下研磨样品。提取总RNA 2 μg 进行反转录获得cDNA。制备cDNA文库后利用Illumina HiSeq 2000平台进行高通量测序。将测序得到的序列片段与参考基因组(ftp://ftp.bioinfo.wsu.edu/species/Fragaria_vesca/)进行匹配，根据FPKM(Fragments Per Kilobase per Million)分析FaERF003在草莓果实不同时期的表达变化。

1.2.5 亚细胞定位 从GDR(https://www.rosaceae.org/)获得FaERF003基因CDS序列，以‘红颜’草莓果实cDNA为模板扩增目的基因，扩增引物利用DNAMAN设计，序列如下：FaERF003 OE-F: 5′ CTGCAGGGGCCCGGGGTCGACATGGAAACAATG CAAGAAAATTACCTCC 3′，FaERF003 OE-R: 5′ CATGGTACCGGATCCACTAGTATTAGCAAGGACT TCCCAGATCAAC 3′。PCR反应体系参照Q5高保真聚合酶说明书，PCR反应程序为95 ℃，5 min；95 ℃，15 s；55 ℃，15 s；72 ℃，1 min；循环32次；72 ℃，5 min。扩增产物经检测正确后纯化回收。使用SalⅠ和SpeⅠ内切酶双酶切pSuper-1300: GFP载体，反应结束后经琼脂糖凝胶电泳纯化回收载体片段，按照无缝克隆试剂盒说明书将载体与基因连接，转化DH5α感受态，筛选阳性克隆，提取质粒测序正确后转化入GV3101感受态细胞。筛选和扩繁阳性克隆，制备农杆菌侵染液，侵染烟草叶片。3 d后用激光共聚焦显微镜观察FaERF003亚细胞定位，重复3次以上。

1.2.6 FaERF003生物信息学分析 利用ExPASy-Translate tool网站(https://web.expasy.Org/translate/)分析FaERF003基因序列及氨基酸序列，利用ExPASy网站(https://web.expasy.org/protparam/)分析FaERF003蛋白分子量(MW)和等电点(pI)等参数。利用NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd)分析FaERF003蛋白保守结构域[12]。从NCBI获得FaERF003在其他植物中的同源ERF003蛋白序列，使用MEGA-7.0软件构建ERF003蛋白的系统进化树。利用Phyre2网站对FaERF003蛋白进行三维结构预测与建模(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)[13]，使用Pymol软件对FaERF003蛋白模型进行标注。

2 结果与分析

2.1 果实不同发育时期ACC的含量

取5个发育时期的草莓果实进行ACC含量测定发现(图1)，在草莓果实发育初期ACC含量极低，随着果实膨大到始红期之前ACC含量缓慢增加，从始红期到片红期ACC含量急剧上升，此时的ACC含量约为始红期3倍(3个生物学重复，*表示P<0.001)。表明乙烯含量在果实成熟后期迅速升高，乙烯可能调控果实成熟后期的生理过程。

2.2 草莓FaERF003基因的表达模式

取草莓4个发育时期果实进行转录组测序，得到草莓基因的FPKM值，数据分析发现基因号为FvH4_5g04470的基因，从大绿期到白果期表达显著升高，白果期到始红期变化不明显，从始红期到片红期迅速升高(图2，2个生物学重复)。序列分析发现，该基因属于AP2/ERF家族，与乙烯响应因子ERF003同源性较高，因此将其命名为FaERF003。为了验证FaERF003在不同果实发育时期的表达模式，荧光定量PCR试验检测FaERF003从小绿到全红相对表达变化，结果显示该基因表达从小绿期到片红期缓慢上升，在全红期迅速上升(图2，3个生物学重复，*表示P<0.001)。FaERF003表达变化趋势与ACC含量变化相似(图1)，暗示该基因可能参与乙烯调控草莓果实成熟的信号转导过程。

2.3 FaERF003基因克隆与系统进化树分析

以八倍体草莓‘红颜’总RNA逆转录的cDNA为模板，克隆出FaERF003基因，全长为894 bp，编码297个氨基酸，与二倍体草莓FvERF061(NCBI Reference Sequence: XM_004298847)相差4个碱基(图3)。

根据FaERF003蛋白的氨基酸序列，利用NCBI网站的Blast功能搜索其他植物的氨基酸序列进行比对，结果显示二倍体草莓FvERF061与八倍体草莓FaERF003序列相似性最高，达99.55%；其次是月季(Rosachinensis)RcERF061蛋白(GenBank登录号: XP_024168572.1)， 序列相似性为84.61%。

从NCBI数据库获得24种植物FaERF003同源蛋白的氨基酸序列，进行同源性比对，利用MEGA7.0软件构建系统进化树(图3)。其中蔷薇科(Rosaceae)植物的ERF003同源蛋白亲缘关系较近，在图中聚为1支。

2.4 FaERF003生物信息学分析

利用ExPASy网站预测FaERF003蛋白的相对分子量MW= 32.9 kD，等电点pI=8.55，为碱性蛋白；负电荷氨基酸残基(Asp+Glu)共33个，正电荷氨基酸残基(Arg+Lys)共36个；稳定性系数计算为40.15；亲水性平均值为-0.499，表明该蛋白为亲水性蛋白。

利用NCBI CD-Search分析FaERF003的功能保守结构域(图4-A)，FaERF003蛋白保守结构域分析发现其属于AP2/ERF家族转录因子，包含ERF家族成员保守的DNA结合域。FaERF003的 DNA结合域由一个α-螺旋和3条反平行β-折叠带构成(图 4-B)，这为FaERF003蛋白参与乙烯信号途径，调控下游基因表达奠定结构基础。

2.5 草莓FaERF003亚细胞定位

为了观测FaERF003的亚细胞定位，进行了烟草叶肉细胞瞬时转化试验，试验发现FaERF003融合绿色荧光蛋白主要在细胞核表达，同时在胞质中也有一定表达。核内绿色荧光能够与细胞核染料DAPI的蓝光重合(图5)，说明FaERF003蛋白能定位于细胞核。细胞核定位为FaERF003行使转录因子的功能提供了空间基础。

3 讨 论

本研究从八倍体草莓‘红颜’中克隆出FaERF003基因，分析表明FaERF003有AP2/ERF家族的保守DNA结合域。该基因的表达量从小绿期到始红期果实着色缓慢上升，在果实成熟后期片红到全红期表达量迅速升高，并在全红期达到最高。这与草莓果实的ACC含量变化趋势相似，推测FaERF003基因的表达水平与草莓果实的乙烯含量相关，FaERF003基因参与果实的乙烯信号转导，促进草莓果实成熟。

通过分析草莓与24个物种的ERF003同源蛋白的进化关系发现，草莓与月季的亲缘关系最近，并且同属蔷薇科的植物在进化树中聚为一支，说明蔷薇科AP2/ERF家族蛋白较为保守。分析FaERF003蛋白的结构及理化性质，结果表明FaERF003蛋白符合AP2/ERF家族的典型特征[7, 14]，如蛋白不稳定、亲水且非分泌以及含有3个β折叠和1个α螺旋的DNA结合区，这为FaERF003蛋白作为乙烯响应因子奠定结构基础。

通过亚细胞定位发现FaERF003蛋白主要定位于细胞核，胞质也有一定表达。基于现有研究，AP2/ERF家族成员大多定位于细胞核，但也有例外，如蔓花生AP2/ERF家族Aradu.SE6Q0和Aradu.42 K79 这2个成员也在细胞核外有定位[14]。FaERF003蛋白的胞质定位可能与乙烯响应有关，乙烯含量升高时可能改变FaERF003的定位，促进FaERF003向细胞核中转移，从而有利于乙烯信号传递。

FaERF003是否影响草莓果实成熟，在草莓果实成熟中如何发挥功能，是否受乙烯或者ABA调控，其定位改变是否受到翻译后修饰等问题，都有待进一步验证。之后的研究将从以下几个方面进行：利用瞬时转化系统和圆片温育试验验证FaERF003的表达和定位是否受乙烯和ABA调控；通过酵母单杂、凝胶迁移等试验验证FaERF003转录因子功能；利用RNA干扰、过表达技术瞬时侵染草莓，通过CRISPR/Cas9技术构建转基因株系，分析草莓FaERF003在果实成熟中的功能，为乙烯调控草莓果实成熟的机制研究提供理论基础。