lncRNA MEG3对视网膜母细胞瘤细胞增殖与迁移的作用及其机制研究△

赵凌军 杨卫民 杨潇远 李季

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)是常见的儿童眼内恶性肿瘤，发病率及死亡率高，严重威胁着患儿视力与生命安全[1-2]。RB传统治疗方法包括放射治疗、化学治疗、激光以及眼球摘除等，但极易引起细菌感染、永久失明等，而且多数预后不良[3-5]。随着现代医疗技术的不断提高，RB的治疗目标从只能保护患儿生命转向提高患儿生存质量；不仅需要保留患儿眼球，更需要保留患儿视功能。长链非编码RNAs(long noncoding RNAs，lncRNAs)是由200多个碱基组成的一种非编码RNA，具有抑制肿瘤细胞增殖与迁移的功能[6]。母系表达基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)定位在人类14q32.3染色体上，在人体正常组织中能够广泛表达，在一些肿瘤细胞中表达下降，且MEG3过表达能够抑制肿瘤细胞增殖与迁移[7-8]。目前，lncRNA MEG3对RB的作用机制相关研究报道较少。因此，本研究基于Wnt/β-catenin信号通路探讨lncRNA MEG3对RB细胞增殖与迁移的作用，为临床RB治疗提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料人RB细胞系SO-Rb50细胞购自上海邦景实业有限公司。胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培养基、Wnt/β-catenin信号通路激活剂氯化锂(LiCl)(美国Gibco公司)；兔抗人Wnt1多克隆抗体、兔抗人β-catenin、Cyclin D1单克隆抗体、辣根过氧化物标记的山羊抗兔IgG(日本TaKaRa公司)；CCK-8试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(美国MedChemexpress生物科技公司)；荧光定量试剂盒、反转录试剂盒(日本TaKaRa公司)；脂质体Lipofectamine TM2000转染试剂盒(Invitrogen公司)；CO2细胞培养箱(美国SIM公司)；DFM-60C倒置荧光显微镜(上海蔡康光学仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养取常规冻存复苏的RB细胞系SO-Rb50细胞，接种于含体积分数10% FBS、100 U·mL-1青霉素及20 mg·L-1庆大霉素的RPMI 1640培养基，置于37 ℃、含体积分数5% CO2培养箱内培养。2～3 d传代一次，选取对数生长期SO-Rb50细胞进行后续实验。

1.2.2 分组与细胞转染取对数生长期的RB细胞，按照200×103个·mL-1的密度将其接种到6孔培养板中，细胞生长密度在70%以上时按照转染试剂盒说明书将质粒与脂质体混匀，室温孵育20 min，转移至不含FBS的RPMI 1640培养基中培育5 h，换成含体积分数10% FBS的RPMI 1640培养基。48 h后在荧光显微镜下观察细胞转染效率达到80%，可以进行后续实验。将RB细胞分为对照组(不做任何处理)、NC组(含lncRNA MEG3-NC无序干扰序列的pcDNA3.1质粒)、lncRNA MEG3组(含lncRNA MEG3序列的pcDNA3.1质粒)、激活剂组(含lncRNA MEG3序列的pcDNA3.1质粒+Wnt/β-catenin通路激活剂LiCl)，激活剂LiCl浓度为25 mmol·L-1。

1.2.3 RT-qPCR检测各组RB细胞中lncRNA MEG3表达取各组转染RB细胞，提取RNA，用反转录试剂盒将其反转录为cDNA进行RT-qPCR。PCR反应条件：预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 15 s；退火58 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 20 s，共45个循环；然后72 ℃ 10 min，4 ℃终止反应。lncRNA MEG3上游引物: 5’-CTTGACTTACCGTGAGTGT-3’，下游引物: 5’-CAGATGCACTTCTCAGACA-3’。采用2-△△Ct法对lncRNA MEG3表达进行定量分析。

1.2.4 CCK-8法检测lncRNA MEG3对RB细胞增殖的影响取各组转染RB细胞，调整RB细胞密度为50×103个·mL-1，接种于24孔细胞培养板中，在37 ℃、含体积分数5% CO2培养箱中分别培养24 h、48 h、72 h后，每孔加10 μL CCK-8试剂，室温继续培养4 h，酶标仪测定490 nm的各孔吸光度(D)值，计算RB细胞增殖抑制率。细胞抑制率=(D对照孔-D处理孔)/D对照孔×100%。

1.2.5 Transwell实验检测细胞迁移取稳定转染各组RB细胞，调整细胞密度为200×103个·mL-1；在Transwell小室下室加入600 μL含体积分数10% FBS的RPMI 1640培养基，上室加100 μL细胞悬液，继续培养24 h。取出小室，吸干上室液体，移入含800 μL甲醇的孔中，固定0.5 h；取出小室，吸干上室甲醇，移入含800 μL Giemsa染液的孔中，染色0.5 h；用清水缓慢冲洗5次，取出小室，吸去上室液体，小心擦去底部膜表面的细胞；揭下膜，底面朝上晾干，中性树胶封片，显微镜下观察。随机取10个视野对RB细胞进行计数，求平均值。

1.2.6 RT-PCR检测各组细胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1的mRNA表达取稳定转染各组RB细胞，用TRIzol法提取细胞总RNA，用TaKaRa逆转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA。检测各组RB细胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1 mRNA相对表达量。引物序列如下：Wnt1上游引物为5’-ACTCTCGACCGCGACTACAG-3’，下游引物为5’-GGCGACTCTCAGAGTGAACC-3’，大小为276 bp；β-catenin上游引物为5’-AAGTCTTGGCTATTACGACA-3’，下游引物为5’-AAGTCCACCTTCACGACCTT-3’ ，大小为253 bp；Cyclin D1上游引物为5’-CAGAGTCAGAGCTTAGGTCT-3’，下游引物为5’-GTAACGGAGTGTGCACAGCG-3’ ，大小为298 bp。PCR反应条件：预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 15 s；退火58 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 25 s，40个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃终止反应。采用2-△△Ct法对RB细胞中不同因子mRNA表达定量分析。

1.2.7 Western blot 检测各组细胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达取各组转染RB细胞，提取总蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量。95 ℃水浴变性8 min，进行聚丙烯酰氨凝胶电泳，电泳结束，转膜至PVDF膜上，封闭液室温封闭2 h，分别加入Wnt1多克隆抗体、β-catenin、Cyclin D1单克隆抗体(按体积比12000 进行稀释)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(按体积比14000进行稀释)，37 ℃孵育1 h。TBST清洗6次，加入ECL显色，拍照。以GAPDH作为内参，检测各组RB细胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1蛋白相对表达水平。

2 结果

2.1 各组RB细胞中lncRNA MEG3相对表达水平比较对照组、NC组、lncRNA MEG3组和激活剂组RB细胞中lncRNA MEG3相对表达水平分别为 0.81±0.27、0.78±0.26、3.88±0.39、3.76±0.38，组间比较差异有统计学意义(F=28.515，P<0.05)。与对照组和NC组相比，lncRNA MEG3组和激活剂组RB细胞中lncRNA MEG3相对表达水平均升高，差异均有统计学意义(与对照组相比:t=14.472、14.151，均为P<0.05；与NC组相比:t=14.789、14.472，均为P<0.05)；NC组与对照组、激活剂组与lncRNA MEG3组RB细胞中lncRNA MEG3相对表达水平比较，差异均无统计学意义(t=0.179，P=0.862；t=0.493，P=0.635)。

2.2 lncRNA MEG3对各组RB细胞增殖的影响CCK-8法检测结果显示：各组RB细胞培养24 h、48 h、72 h细胞增殖抑制率组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与NC组相比，lncRNA MEG3组RB细胞培养24 h、48 h、72 h细胞增殖抑制率逐渐升高，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；与lncRNA MEG3组相比，激活剂组RB细胞培养24 h、48 h、72 h细胞增殖抑制率逐渐降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。激活剂组与NC组RB细胞培养24 h、48 h、72 h 细胞增殖抑制率比较，差异均无统计学意义(均为P>0.05)。NC组、lncRNA MEG3组、激活剂组RB细胞增殖抑制率均随时间延长而升高，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(见表1)。

表1 lncRNA MEG3对各组RB细胞增殖的影响

2.3 lncRNA MEG3对各组RB细胞迁移的影响对照组、NC组、lncRNA MEG3组和激活剂组RB细胞迁移数分别为(78.50±8.01)个、(72.80±7.25)个、(26.60±3.03)个、(54.60±5.79)个，组间细胞迁移数比较，差异有统计学意义(F=49.581，P<0.05)。与对照组相比，lncRNA MEG3组和激活剂组细胞迁移数均减少，差异均有统计学意义(t=13.551、5.407，均为P<0.05)；与NC组相比，lncRNA MEG3组和激活剂组细胞迁移数也均减少，差异也均有统计学意义(t=13.147、4.386，均为P<0.05)；与lncRNA MEG3组相比，激活剂组细胞迁移数增多，差异有统计学意义(t=9.581，P<0.05)；NC组与对照组细胞迁移数相比，差异无统计学意义(t=1.180，P=0.272)(见图1)。

图1 各组RB细胞迁移情况(放大倍数：×200) A：对照组；B：NC组；C：lncRNA MEG3组；D：激活剂组。

2.4 各组RB细胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1的mRNA相对表达水平比较qRT-PCR检测结果显示：与对照组和NC组相比，lncRNA MEG3组和激活剂组RB细胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1 mRNA相对表达水平均降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；与lncRNA MEG3组相比，激活剂组RB细胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1 mRNA相对表达水平均升高，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。NC组与对照组RB细胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1 mRNA相对表达水平相比，差异均无统计学意义(均为P>0.05)(见表2)。

表2 各组RB细胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1 mRNA相对表达水平比较

2.5 各组RB细胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1蛋白相对表达水平比较Western blot检测结果显示,与对照组和NC组相比，lncRNA MEG3组和激活剂组RB细胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1蛋白相对表达水平均降低(均为P<0.05)；与lncRNA MEG3组相比，激活剂组RB细胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1蛋白相对表达水平均升高(均为P<0.05)；NC组与对照组RB细胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1蛋白相对表达水平相比，差异均无统计学意义(均为P>0.05)(见表3、图2)。

表3 各组RB细胞中Wnt1、β-catenin、Cyclin D1蛋白相对表达水平比较

图2 各组RB细胞中不同因子蛋白的表达 A：对照组；B：NC组；C：lncRNA MEG3组；D：激活剂组。

3 讨论

RB是儿童中多发的遗传性眼内恶性肿瘤，严重影响患儿外貌、视力、心理发育等，甚至威胁患儿的生命安全。lncRNAs在多种疾病中发挥重要作用，甚至包括肿瘤。研究发现lncRNAs在肿瘤的发生进展过程中具有抑癌基因的作用，影响肿瘤细胞的增殖、侵袭等过程[9]。MEG3是潜在的抑癌基因，其表达产物是第一个被发现具有肿瘤抑制功能的lncRNA。Zhang等[10]研究发现，宫颈癌组织中lncRNA MEG3呈低表达，在宫颈癌细胞中高表达lncRNA MEG3可以增加细胞凋亡及减少细胞增殖。lncRNA MEG3在RB中研究较少，且其作用机制尚未完全清楚。缪珊珊等[11]研究发现，萝卜硫素能够抑制RB细胞系 Y79细胞增殖并诱导其凋亡，可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路活化有关。因此，本研究分析了lncRNA MEG3对RB细胞增殖、迁移的作用，并探讨是否与Wnt/β-catenin信号通路活化有关。

细胞增殖和凋亡在正常情况下维持着动态平衡，增殖失控或凋亡受阻导致平衡被打破，进而肿瘤发生。有研究发现lncRNA MEG3通过调控Notch信号通路有效抑制子宫内膜癌细胞增殖[12]。Lu等[13]在非小细胞肺癌的细胞系中过表达lncRNA MEG3后检测细胞功能变化，结果显示,细胞增殖明显减少，细胞凋亡增加，提示lncRNA MEG3在非小细胞肺癌中发挥抑癌作用。另外，lncRNA MEG3在肺癌及肝癌细胞的增殖与凋亡中也起关键作用[14-15]。本研究结果也显示，lncRNA MEG3组较对照组RB细胞增殖抑制率升高，细胞迁移数减少；且RB细胞增殖抑制率随作用时间延长而升高，表明过表达lncRNA MEG3能够抑制RB细胞增殖及迁移能力。

Wnt/β-catenin信号通路广泛存在于多细胞生物体内，由Wnt基因调控，在胚胎发育、细胞增殖与分化等生命过程中发挥重要作用，并参与调控肿瘤细胞增殖、迁移与凋亡过程[16-17]。在正常分化的细胞中，细胞膜上的β-catenin蛋白被磷酸化，通过泛素化降解，导致细胞质中游离β-catenin蛋白减少，不能激活Wnt/β-catenin信号通路下游效应因子的表达。当Wnt/β-catenin信号通路被异常激活时，β-catenin和Wnt蛋白表达异常，激活下游Cyclin D1蛋白，使Cyclin D1蛋白异常表达，促进细胞增殖和迁移，参与肿瘤发生发展[18]。研究表明，Wnt/β-catenin信号通路是人类多种疾病发生的关键，其被异常激活会促进肿瘤的发生发展[19-20]。邓荣华等[21]研究发现，过表达lncRNA MEG3可通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌细胞增殖，促进细胞凋亡。Liu等[22]通过对口腔鳞状细胞癌进行研究，发现lncRNA MEG3能够通过Wnt/β-catenin信号通路参与疾病的发生发展。本研究结果也发现，与对照组和NC组相比，lncRNA MEG3组RB细胞Wnt1、β-catenin、Cyclin D1 mRNA和蛋白相对表达水平均降低；添加Wnt/β-catenin信号通路激活剂后，与lncRNA MEG3组相比，激活剂组RB细胞Wnt1、β-catenin、Cyclin D1 mRNA和蛋白相对表达水平均升高，表明lncRNA MEG3抑制RB细胞增殖及迁移，可能是通过增强Wnt1、β-catenin蛋白的磷酸化，加速泛素化降解，抑制Cyclin D1等靶基因的转录从而阻断Wnt/β-catenin信号通路，抑制RB细胞的增殖及迁移。

综上所述，lncRNA MEG3能够抑制人RB细胞的增殖和迁移，其机制可能是通过阻断Wnt/β-catenin信号通路来发挥作用的。本研究结果可为RB的临床治疗提供一定的理论依据。