外源硫化氢对NaCl胁迫下棉花幼苗抗逆生理特性的影响

陈明媛，张淑英，王梦柯，吴 莺

(石河子大学农学院，新疆 石河子 832003)

土壤盐渍化作为世界性的资源和生态问题之一[1]，对农业生产造成很大的负面影响。新疆地理位置特殊，位于我国西北干旱区，由于水资源匮乏、蒸发量大及灌溉方式不合理，使新疆土壤的次生盐渍化面积大范围扩大[2]。在盐渍条件下, 植物为维持其基本生命特征会激活体内多种生理生化机制[3],如棉花叶片叶绿体降解、叶绿素流失及光合速率下降，从而降低棉花叶片对光能的捕获和利用，诱导衰老相关转录因子基因的表达，引起叶片早衰[4]。新疆已成为我国最大的棉花生产基地，棉花产业在新疆农业产业化中占据着主导地位[5]，研究棉花耐盐机制及抗盐保护措施，对提高新疆现有棉花的生产能力具有现实意义。

硫化氢(H2S) 作为一种重要的内源气体信号分子，在促进叶绿体的生物合成和增强光系统酶的表达功能上均表现出重要作用[6]。现已证实外源H2S处理显著提高了番茄幼苗抗氧化水平，不仅能缓解盐胁迫对加工番茄幼苗造成的氧化损伤，还能提高加工番茄幼苗对盐胁迫的适应和抵抗能力[7]。H2S亦可以增强草木樨对抗盐胁迫的能力，减小细胞膜的透性[8]。王燕琴[9]研究表明，H2S能促进苜蓿种子的萌发，缓解由盐胁迫引起的氧化伤害。然而，H2S对盐胁迫下棉花幼苗生长及光合特性的影响却少有报道。本试验采用盆栽法，在盐胁迫下通过外源喷施NaHS (H2S供体) 处理棉花幼苗，研究外源H2S对盐胁迫下棉花幼苗光合特性及抗氧化酶活性的影响，探讨H2S对盐胁迫下棉花生长发育的生理响应机制，以期为新疆棉花生产中的抗盐问题提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验于2019年4月在石河子大学试验站进行。供试棉花品种为新陆早48号，外源硫化氢(H2S)供体为NaHS。

1.2 试验设计

试验设盐分(NaCl分析纯，0、100、200 mmol·L-1)和硫化氢供体(NaHS分析纯，0、20、50、100、500 μmol·L-1)两因素交互，共11个处理(如表1所示)，每处理重复3次。试验采用室外盆栽栽培，挑选大小均匀的棉花种子于(25±1)℃光照培养箱内进行催芽处理，将发芽种子播种于蛭石为基质的营养钵中，营养钵放置于周转箱内。待棉花幼苗长至两叶一心时配制Hoagland营养液进行浇灌，一周后进行盐分处理。盐胁迫一周后进行外源H2S处理。其中，盐分处理是将NaCl直接溶于营养液中进行浇灌，H2S处理则将NaHS溶于蒸馏水中按不同浓度处理进行叶面喷施。出苗60 d后取倒三、倒四叶测定各项指标。

表1 试验处理及对应编号

1.3 测定项目

将棉花幼苗根、茎、叶分离并测定鲜质量后装入牛皮纸袋中，在烘箱中105℃杀青30 min后，烘干至恒重，分器官称量干质量，由“根系干质量/茎叶干质量”计算得出根冠比；叶绿素(Chl)含量的测定参考乙醇-丙酮混合法[10]；利用调制荧光仪 (Imaging-PAM，WALZ,德国)，将幼苗功能叶遮光处理30 min后，测定叶绿素荧光参数光化学猝灭系数(qP)、非光化学猝灭系数(qN) 、PSⅡ调节性能量耗散[Y(NPQ)]、PSⅡ非调节性能量耗散[Y(NO)]；利用光合仪(Li-6400，LI-COR,美国)测定净光合速率(Pn)，蒸腾速率(Tr)，气孔导度(Gs)和胞间CO2浓度(Ci)等光合气体参数；过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚氧化法[11]，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑(NBT)法[12]，过氧化氢酶(CAT)活性采用分光光度计法[13]。

1.4 数据统计分析

采用Microsoft Excel 2010进行数据处理，用SPSS 19.0进行统计分析，并运用Duncan法进行差异显著性检验(p<0.05)，用Sigmaplot 14.0作图。

2 结果与分析

2.1 外源H2S对盐胁迫下棉花幼苗生长的影响

由表2可以看出，200 mmol·L-1NaCl胁迫比100 mmol·L-1NaCl胁迫对棉花幼苗地上部鲜质量、地上部干质量及地下部干质量产生了更大程度的抑制作用。未添加H2S处理的棉苗生物量随NaCl浓度的升高而减少，其中T1与CK相比，棉花地上部鲜质量、地上部干质量和地下部干质量分别下降了37.24%、45.31%、29.63%；K1与CK相比，地上部鲜质量、地上部干质量和地下部干质量分别下降了47.59%、50.78%、37.04%。相同NaCl不同H2S浓度处理下棉花幼苗生物量均有不同程度的增长，如T2、T3、T4、T5与T1相比，棉苗地上部鲜质量分别增加了35.34%、28.79%、9.31%、19.66%，H2S浓度为100 μmol·L-1(T4、K4处理)时地上部鲜质量、地上部干质量最大。说明外源H2S能提高棉花幼苗对盐胁迫的抵抗能力，缓解棉花幼苗生长过程中NaCl胁迫带来的抑制作用，且以H2S浓度为100 μmol·L-1时效果最佳。

方差分析表明，棉花幼苗地上部鲜质量、地上部干质量和地下部干质量随NaCl浓度升高而显著下降(p<0.01)。NaCl与H2S交互作用，各处理棉花幼苗地上部鲜质量、地上部干质量、地下部干质量和根冠比均与CK间差异显著(p<0.05)。

2.2 外源H2S对盐胁迫下棉花幼苗光合色素含量的影响

由图1可知，NaCl胁迫使棉花幼苗叶片Chl a(图1A)、Chl b(图1B)和Chl a/b(图1C)均明显下降，尤其是NaCl浓度为100 mmol·L-1时显著(p<0.05)降低了棉花幼苗叶片中各叶绿素组分含量。相同Nacl浓度下，喷施NaHS后，棉苗叶片叶绿素含量呈现出随NaHS浓度增大而先升后降的趋势，如同样是在100 mmol·L-1Nacl胁迫下，T2、T3、T4处理Chl a含量较T1分别提高了4.19%、8.87%和13.45%，而T5则较T1降低了4.08%，说明外源H2S能缓解NaCl胁迫对Chl a生物合成的抑制作用，但H2S浓度过高却降低了这种缓解效应。Chl b、Chl(a+b)变化趋势与Chl a相似。方差分析表明，H2S浓度相同各处理下棉花幼苗叶绿素含量均随NaCl浓度升高而显著(p<0.05)降低；相同NaCl胁迫时棉苗Chl含量则随外源H2S浓度升高而显著(p<0.05)升高；NaCl与H2S互作各处理棉苗叶绿素含量与CK差异显著(p<0.05)。

表2 外源H2S对盐胁迫下棉花单株幼苗生物量的影响/g

2.3 外源H2S对盐胁迫下棉花幼苗叶绿素荧光参数的影响

如图2所示，CK棉苗各叶绿素荧光参数[qP、qN、Y(NPQ)和Y(NO)]均最高，说明NaCl胁迫对棉花幼苗PSⅡ造成了严重危害，抑制棉花幼苗光合作用正常进行。相同浓度NaCl胁迫条件下，随着NaHS施入，qN、Y(NPQ)和Y(NO)均有所升高，如T4与T1相比，棉花幼苗Y(NPQ)、Y(NO)和qN分别提高了20.54%、10.14%、5.27%；K4与K1相比，Y(NPQ)、Y(NO)和qN分别提高了16.74%、2.27%、2.65%，说明外源H2S能有效抑制NaCl胁迫对棉花幼苗PSⅡ的危害，提高光能的吸收和电子传递速率，且以浓度为100 μmol·L-1NaHS处理效果最佳。方差分析表明，棉花幼苗qP、qN、Y(NPQ)和Y(NO)随NaCl浓度升高而显著下降(p<0.05)；相同NaCl胁迫处理下，棉苗qP、qN、Y(NPQ)和Y(NO)随外源H2S浓度升高而显著升高(p<0.05)；NaCl与H2S交互作用各处理棉花幼苗qP、qN、Y(NPQ)、Y(NO)等叶绿素荧光参数与CK间差异显著(p<0.05) 。

2.4 外源H2S对盐胁迫下棉花幼苗光合气体参数的影响

由图3A可以看出，相同浓度的NaCl胁迫条件下，Pn随H2S浓度的增大而增大，说明外源H2S可有效缓解NaCl胁迫对光合的抑制作用，提高了棉花幼苗净光合速率。Gs(图3B)同Pn的变化趋势一致，经H2S处理后，棉苗Gs逐渐升高，如T2、T3、T4、T5与T1相比分别提高了21.38%、30.17%、37.74%、25.70%，说明H2S处理能提高NaCl胁迫下棉花叶片的气孔导度，提高叶片与外界环境对CO2的交换作用，促进光合碳同化有效运转。Ci(图3C)和Tr(图3D)的CK处理测定值最大， K1与之相比，分别降低了13.28%和20.05%，说明NaCl胁迫使棉花幼苗光合作用减弱，降低了植株的光能利用率。方差分析表明，棉花幼苗的Pn、Gs、Tr和Ci随NaCl浓度升高而显著下降(p<0.05)；NaCl与外源H2S互作各处理下棉花幼苗的Pn、Gs、Tr和Ci均与CK间差异显著(p<0.05)。

2.5 外源H2S对盐胁迫下棉花幼苗抗氧化酶活性的影响

盐胁迫使植物体内产生过多活性氧(ROS)，而POD、SOD和CAT是活性氧清除系统中的关键作用酶，在降低超氧阴离子和过氧化氢对植物自身膜系统的损伤中起着重要作用[14]，三者共同被称为植物体内活性氧的清除剂。POD、SOD和CAT活性常用来作为判定植物耐盐性的重要指标[15]。由图4A可以看出，与CK相比，T1、K1棉花幼苗POD活性分别下降了47.03%、57.64%，说明NaCl胁迫降低了POD活性，且NaCl浓度越大抑制效应越明显。不同浓度H2S处理(K2、K3、K4、K5)与K1相比，棉苗POD活性分别提高了23.56%、43.00%、85.02%、32.54%，说明外源H2S处理使NaCl胁迫下棉花POD活性升高，有效增强了植株抗氧化能力，从而提高了棉株抗盐性，其中，K4处理效果最佳。

如图4B所示，NaCl胁迫导致棉苗SOD活性显著降低(p<0.05)，如T1较CK降低了41.75%。喷施不同浓度H2S后，棉花幼苗 SOD活性呈先升后降趋势，以100 μmol·L-1H2S处理(T4、K4)SOD活性最高，说明外源H2S能缓解NaCl胁迫对棉花幼苗抗氧化酶活性的抑制作用，但浓度过高或过低时，缓解效果都会大大减弱。

CAT活性(图4C)变化趋势与POD、SOD相似，表现为NaCl胁迫使CAT活性下降，且随NaCl胁迫加剧CAT活性下降程度越来越大，而外源H2S的加入缓解了这种效应。方差分析表明，H2S浓度相同处理下，棉花幼苗CAT活性随NaCl浓度升高而显著(p<0.05)降低；相同NaCl胁迫棉苗CAT活性随外源H2S浓度升高而显著(p<0.05)升高；NaCl与H2S交互作用，各处理棉苗CAT活性与CK差异显著(p<0.05)。

3 讨论与结论

3.1 外源H2S对盐胁迫下棉花幼苗生长的影响

盐胁迫减弱了植物光合碳同化的能力，使光合色素降解，从而制约了植株的生长发育，降低了植株生物量[16]。董建梅等[17]研究表明盐胁迫抑制石榴实生苗生长，随盐浓度增加单株生物量呈先升后降趋势。单长卷等[18]在对水分胁迫下的玉米种子研究中发现，外源H2S处理显著降低了逆境胁迫对种子萌发的抑制效应，增大了玉米根长和根重，显著降低了相对伤害率。本研究中盐胁迫显著降低了棉花幼苗地上部鲜、干质量及地下部干质量，外源H2S缓解棉花幼苗生长过程中NaCl胁迫带来的抑制作用，这与董建梅[17]、单长卷等[18]的研究结果基本一致。

3.2 外源H2S对盐胁迫下棉花幼苗光合色素含量的影响

光合色素含量是一项可以直观反映出植物光合作用强弱程度的生理指标[19]，在对光能的吸收与利用中有着举足轻重的作用。吴永波等[20]对白蜡树的研究结果表明，盐胁迫环境对叶绿素生物合成造成了次生破坏，且随盐浓度升高白蜡幼苗叶片叶绿素含量逐渐降低。Aslam等[21]在棉花上进行了铅胁迫下外施H2S试验，表明通过外源喷施H2S显著提高了光合色素含量，与本研究结果一致，低浓度H2S有效缓解盐胁迫引起的棉花幼苗光合色素含量的下降，能够降低盐胁迫对棉花幼苗光合系统的伤害，增强棉花叶片对光能的吸收和利用。

3.3 外源H2S对盐胁迫下棉花幼苗叶绿素荧光参数的影响

叶绿素荧光能够直接反映植物PSⅡ系统活性以及电子传递情况的变化。本研究显示，随着盐胁迫加剧，qP、qN、Y(NPQ)、Y(NO)也随之减小，这与彭方仁等[22]研究不同树种幼苗的结果一致，其研究表明盐胁迫使植株PSⅡ反应中心活性下降, 叶片受到光抑制, PSⅡ反应中心受到不同程度的损伤；前人亦有研究表明，NaCl胁迫下茄子幼苗光系统反应中心受到损伤,光合电子传递过程受到抑制[23]，最终导致叶绿素荧光参数下降。本研究还发现，喷施H2S后，棉花幼苗的qP、qN、Y(NPQ)、Y(NO)明显提高，可能是由于外源H2S能有效提高PSII光化学活性，增强非环式电子传递效率，缓解光合机构受到的光氧化损伤。

3.4 外源H2S对盐胁迫下棉花幼苗光合气体参数的影响

盐胁迫致使棉花叶片气孔关闭、CO2进入叶肉细胞速率下降，Pn、Gs、Ci和Tr减小，棉株光合作用减弱[24]。高晓兰[25]认为，外源H2S处理能有效提高桃树Pn，改善叶片光合性能,并且促进了植株的形态建成。本研究中随着盐浓度的增加Gs显著降低，可能是盐离子在植株体内的不断积累导致了叶片气孔关闭、叶绿体结构遭到破坏，气孔导度下降，并且由此还进一步引起了Pn下降。而H2S施入后，Pn、Gs、Ci和Tr均明显提高，说明H2S处理能提高叶片与外界环境对CO2的交换作用，促进光合碳同化的有效运转，提高了光合性能。这与前人[24-25]的结论基本相同。

3.5 外源H2S对盐胁迫下棉花幼苗抗氧化酶活性的影响

盐离子过度增加会降低植株抗氧化酶(SOD、POD、CAT等)活性，削弱其清除植株体内活性氧(ROS)的效率，使ROS逐步积累，过量ROS引起膜脂过氧化，破坏细胞膜功能，导致植物体内代谢失调[26]。盐胁迫降低了储藏物质分解和转化速率，降低棉苗SOD、POD、CAT活性，造成植株体内活性氧产生和清除系统动态平衡的破坏[27]。本研究中NaCl胁迫使棉花幼苗POD、SOD及CAT活性下降，显著降低了植株抗氧化能力，使棉株抗盐能力减弱，这与翁亚伟[26]、李笑佳等[27]研究结论相似，但与郑庆柱等[28]对盐胁迫下青稞幼苗的研究结果不一致，可能是不同作物对盐胁迫应激反应不同而造成的差异。H2S在盐胁迫下具有通过激活抗氧化酶活性进而修复植株抗氧化还原系统的能力[29]。本研究中，随着外源H2S的加入，棉花幼苗POD、SOD及CAT活性增大，缓解了盐胁迫对棉株抗氧化酶系统的损伤，降低了盐胁迫带来的危害。

综上所述，20～500 μmol·L-1外源H2S均能有效缓解棉花盐害，其中尤以外源H2S浓度为100 μmol·L-1时效果最佳。H2S处理可调控盐胁迫下棉花幼苗的生理代谢，促进其生长；通过提高叶绿素含量、叶绿素荧光参数(qP、qN、Y(NPQ)、Y(NO))及光合气体参数(Pn、Gs、Ci和Tr)以提高光合作用强度，增强植株对光能的利用效率。本研究还发现，喷施外源H2S后，棉花幼苗qP、qN、Y(NPQ)、Y(NO)明显提高，可能是由于外源H2S能有效提高 PS II光化学活性，增强非环式电子传递效率，缓解光合机构受到的光氧化损伤。同时H2S在抗氧化酶体系中作用最为明显，通过增强抗氧化酶的活性来减少盐胁迫导致的过氧化损伤以及活性氧自由基对机体造成的伤害，从而保护膜结构，促进棉花幼苗更好地生长发育。因此推测在盐胁迫下外源H2S能使清除H2O2的酶类活性显著提高，使细胞受害程度得到缓解。而H2S对盐胁迫下棉花幼苗生长及光合特性的影响鲜有报道，因此，本试验可为进一步阐释棉花幼苗抗盐机制提供一定的理论依据。