外源ABA和钨酸钠对干旱胁迫下白菜型冬油菜ZEP表达的影响

李学才，常 瑜，白 静，武军艳，李博文，赵玉红，孙柏林，王万鹏，唐德耀，范小龙，朱文英，马 骊，孙万仓

(1.甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省农业技术推广总站，甘肃 兰州730020；3.甘肃省康县茶叶科技开发中心，甘肃 陇南 746500；4.甘肃省崆峒区农业技术推广中心，甘肃 平凉 744000)

世界上有灌溉条件的耕地面积尚不足15%，其余皆为依靠自然的雨养农业区[1-2]。随着气候变暖及陆地表面趋向干旱化，水资源短缺成为限制农业发展的主要因素之一[3-4]。中国北方大部分地区属干旱、半干旱地区，面积约占我国陆地面积的50%，其生态环境脆弱、气候异常多变、水资源匮乏,农业生产因干旱受到严重损失[5]。

脱落酸(Abscisic acid，ABA)是一种重要的倍半萜类植物内源激素，不仅参与胚胎发育、种子休眠、叶片衰老等生长发育过程，同时又是植物体内的一种抗胁迫激素，参与传递逆境信号，诱导植物产生一系列抗逆反应，提高植物的抗逆性。玉米黄质环氧化酶(Zeaxanthin epoxidase，ZEP)是一种类囊体膜基质面的双功能单加氧酶，其主要作用是将玉米黄质环氧化形成花药黄质，再进一步环氧化形成紫黄质。分子氧和NADPH是ZEP的协同作用底物，FAD是其辅助因子，能够提高其催化活性[6]。研究表明ZEP是黄质醛转变成ABA的间接合成途径中的关键调控酶[7]。拟南芥(Arabidopsisthaliana)中ABA1缺失突变体表现为玉米黄质无法转化为紫黄质，烟草中则为ABA合成反应第一步无法进行[8]。ZEP在不同环境胁迫下的表达模式随植物种类和组织而发生变化。在烟草和番茄中，根中ZEP的表达量在干旱胁迫后显著上升，而叶片中的表达量基本不发生变化[9-10]。Audran等[11]却发现烟草叶片中ZEP的表达量在干旱胁迫下急剧下降。过表达ZEP会导致番茄对强光的敏感性增加，也会使转基因拟南芥中ABA含量上调[12-13]。Park等[14]研究发现，拟南芥过表达AtZEP基因，转基因植株在盐胁迫和旱胁迫条件下生长更旺盛。通过RNA-seq技术对甘蓝型油菜的耐旱基因进行挖掘发现，干旱胁迫下ZEP、NCED等参与ABA合成基因的高表达提高植株的耐旱性[15]。在逆境条件下，植物体内合成大量的ABA，可以促进气孔关闭，抑制气孔开放，抑制植物的光合作用，从而减缓逆境环境对植物造成的伤害，增强植物的抗逆性。

白菜型冬油菜是我国北方寒旱区重要油料作物之一，具有生育期短、耐迟播、耐贫瘠、抗逆性强的突出优点。北方白菜型冬油菜3月中下旬开始返青，进入需水旺盛期，但北方4—6月为旱季，7—9月才进入降雨期，油菜返青后需水期与降雨期不同步，对北方冬油菜生产造成了严重影响[16]。因此，研究北方白菜型冬油菜的抗旱性具有重要意义。本课题组前期研究表明[17]，超强抗寒白菜型冬油菜品种根系及叶片的ABA含量升高时期早于弱寒性品种，白菜型冬油菜根系ABA 含量与其越冬率和抗寒性呈显著正相关。因此，本研究对ABA合成途径中的关键调控酶基因ZEP进行克隆并分析其在干旱胁迫下的表达模式，进一步揭示ZEP基因在白菜型冬油菜抗旱响应中的作用，为白菜型冬油菜抗旱机理研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及胁迫处理

以白菜型冬油菜陇油7号和天油4号为试验材料。选择健康、均匀的种子用0.1% NaClO消毒10 min后，用蒸馏水冲洗2～3次，播种在铺有2层滤纸的培养皿中进行种子萌发(光照14 h，25℃；黑暗10 h, 25℃)，待胚根露白后播种至装有基质的花盆中，培养至五叶期选择生长健康的植株进行胁迫处理。

试验设置4个处理：T1：对照(CK)，喷施蒸馏水200 mL；T2：喷施20 mg·L-1ABA 200 mL；T3：喷施10 mmol·L-1钨酸钠200 mL；T4：同时喷施20 mg·L-1ABA 100 mL和10 mmol·L-1钨酸钠100 mL。试验材料处理前7 d始终保持花盆内土壤持水量在70%～80%，并用土壤水分仪(恒美HM-WSYP)监测每日土壤含水量[18]。将试验材料放置于光照培养箱中(光照14 h，25℃；黑暗10 h，25℃；相对湿度45%)进行干旱处理，取第0天(Normal)和第7天(Drought)植株叶片和根系，并液氮冷冻后存储于-80℃冰箱。

1.2 ZEP基因的克隆

参照TIANGEN天根生化科技(北京)有限公司试剂盒(DP419)说明书提取总RNA，质量检测后按照TakaRa大连宝生物有限公司PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒的方法合成cDNA，检测质量及浓度后-20℃保存。

根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)提供的白菜型油菜的玉米黄质环氧化酶(ZEP)基因的CDS序列，利用Primer 5.0设计扩增引物。引物序列为ZEP-F：5’-ATGGGTTGTTCAACTCCCTTCTGCT-3’；ZEP-R：5’- TCAAGCAGCCTGAAGCAATTTACCG -3’。以陇油7号(CK)叶片cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增程序为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环；72℃ 10 min；16℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物片段大小，参照Axygen Prep DNA凝胶回收试剂盒(离心柱型)说明书回收目的条带。采用pMD-19T载体连接回收产物，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆进行测序(生工生物工程上海股份有限公司)。

1.3 ZEP基因的生物信息学分析

采用ORF Finder软件对ZEP的核酸序列、氨基酸序列和开放阅读框进行分析，利用Protparam工具进行蛋白质基本理化性质分析，氨基酸疏水性分析采用Protscale，跨膜结构预测采用TMpred Server软件，采用Signal P4.1 Server预测蛋白信号肽，利用SOPMA工具预测蛋白质二级结构，保守结构域分析用SMART工具。利用DNAMAN进行白菜型冬油菜ZEP基因的氨基酸序列比对及进化树构建。

1.4 ZEP基因的表达量

依据实时荧光定量PCR引物设计原则设计白菜型油菜ZEP基因(XM_009105212.3)qPCR引物。以相同浓度陇油7号和天油4号cDNA为模板，以白菜型油菜β-actin(Actin-F，5'-GTGTCATGGTTGGGATGGGT-3';Actin-R，5'-AAGAACCGGGTGCTCTTCAG-3')作为内参[15]。实时荧光定量PCR按照Unique Aptamer TM qPCR SYBR® Green Master Mix试剂盒说明书(天津诺禾致源生物信息科技有限公司)，采用两步法，扩增程序为：95℃ 5 min；95℃ 10 sec，60℃ 30 sec，40个循环；熔解曲线：95℃ 15 sec，60℃ 60 sec，95℃ 15 sec。采用2-ΔΔCt法[19]对ZEP基因的表达量进行分析。

2 结果与分析

2.1 白菜型冬油菜ZEP基因克隆及序列分析

以陇油7号叶片cDNA为模板，进行PCR扩增，纯化回收目的片段，连接T载体后转化大肠杆菌，利用菌液PCR筛选阳性克隆，得到一条2 000 bp左右的目的片段(图1)。对挑选的阳性克隆进行测序，结果显示该基因全长为2 013 bp。

利用NCBI ORF finder对陇油7号的ZEP基因碱基序列查找开放阅读框，结果显示，该序列含有一个长度为2 013 bp的完整开放阅读框，编码含670个氨基酸的蛋白质，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA(图2)。利用ProtParam在线软件预测ZEP基因编码蛋白质的理化性质，结果显示：ZEP蛋白的分子式为C3294H5172N912O980S25，由20种氨基酸组成，Gly(G)、Leu(L)所占比例最高，分别为10.0%、8.2%；含有酸性氨基酸(D、E)88个、碱性氨基酸(K、R)83个、疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)234个和极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)142个；预测相对分子质量为74.03 kDa，理论等电点(pI)为6.16；预测不稳定指数为46.09，属于不稳定蛋白(稳定系数>40即为不稳定蛋白质)；预测脂肪指数为81.94，平均亲水性值(Grand average of hydropathicity)为-0.261(图3A)，说明ZEP基因编码的蛋白是亲水性蛋白。

白菜型冬油菜陇油7号ZEP蛋白的N-末端信号肽预测结果表明，该蛋白无信号肽(图3B)。利用TMpred分析ZEP蛋白氨基酸序列，结果显示含有3个跨膜区段(图3C)；利用SOPMA 预测ZEP蛋白二级结构，结果显示该蛋白无规则卷曲(Random coil)占42.39%，α-螺旋(α-helix)占30.45%，延伸链(Extended strand)占19.85%，β-转角(β-turn)占7.31%(图3D)。采用SMART在线软件对陇油7号ZEP保守序列进行预测，结果表明，该基因编码的蛋白具有非常保守的结构域：黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合位点和57个氨基酸组成的FHA结构域(图3E)。

2.2 陇油7号ZEP蛋白同源性和亲缘关系

利用DNAMAN及BLASTP对陇油7号与其他十字花科植物ZEP蛋白同源性进行比较，结果表明，陇油7号ZEP蛋白序列与其他植物的ZEP氨基酸序列相似性很高，与甘蓝型油菜、甘蓝、大白菜、萝卜以及拟南芥ZEP基因的相似度分别为99.40%、97.16%、98.81%、95.52%、89.25%(图4)。从进化树分析发现(图5)，陇油7号与天油4号的ZEP蛋白在进化上同甘蓝型油菜(Brassicanapus)、大白菜(Brassicarapasubsp.pekinensis)的ZEP氨基酸序列亲缘关系更近。

2.3 干旱处理后喷施ABA与钨酸钠对叶片ZEP基因表达的影响

利用qPCR分析外源喷施ABA与钨酸钠对干旱胁迫下白菜型冬油菜陇油7号、天油4号叶片中ZEP基因表达量的影响，结果如图6所示，将未进行干旱处理的白菜型冬油菜叶片的ZEP基因的表达量定为Normal，干旱胁迫后陇油7号和天油4号叶片中ZEP基因均上调表达。干旱胁迫处理喷施ABA后，2个品种ZEP表达量在转录水平上显著高于CK，陇油7号、天油4号较CK分别增加66.63%、75.35%；干旱胁迫处理喷施钨酸钠后，2个品种的ZEP基因表达量在转录水平上均低于CK，陇油7号、天油4号较CK分别减少12.74%、16.32%；干旱胁迫处理并同时喷施ABA和钨酸钠后，陇油7号、天油4号较CK的ZEP基因表达量分别增加3.3倍和2.28倍。

2.4 干旱处理后喷施ABA与钨酸钠对根系ZEP基因表达的影响

外源喷施ABA与钨酸钠对干旱胁迫下白菜型冬油菜根系中ZEP表达量的影响如图7所示，未进行干旱处理的白菜型冬油菜根系的ZEP基因的表达量为1，陇油7号和天油4号2个品种ZEP基因均上调表达。喷施ABA干旱处理后，陇油7号、天油4号较CK的基因表达量分别增加1.18倍和1.74倍。喷施钨酸钠根系中ZEP在转录水平上低于CK，干旱胁迫后，陇油7号、天油4号较CK减少了12.52%和11.44%。同时喷施ABA和钨酸钠，干旱胁迫下，陇油7号、天油4号较CK的基因表达量分别增加1.07倍和1.27倍。

3 讨论与结论

干旱胁迫下，植物对外界环境的刺激做出反应，产生各种代谢产物以适应外界环境。ABA是植物产生的重要激素，在逆境胁迫中可调节植物的代谢活动，提高植物的抗逆能力。ABA在植物受干旱胁迫时通过信号传导，调控胁迫基因表达，调节植物体内蛋白、激素等物质的积累，从而增强植物对环境的适应能力[20]。玉米黄质环氧化酶ZEP是ABA合成反应第一步的调控酶，催化玉米黄质(Z)经单环氧玉米黄质(A)向双环氧紫黄质(V)的转化[21-22]。这一反应在植物叶黄素循环途径、ABA合成途径以及类胡萝卜素循环中都具有重要作用[23-25]。ABA 合成抑制剂钨酸钠通过抑制 ABA 合成中的醛氧化酶原(ABA-aldehydeoxidase)使得 ABA 醛不能转化为 ABA[26]。本研究发现，干旱胁迫下，白菜型冬油菜叶片和根系中ZEP基因均上调表达。邓昌哲等[27]研究表明，ABA合成抑制剂在类胡萝卜素降解途径中可抑制ZEP的表达，本试验发现，喷施ABA后，无论叶片或根中，ZEP基因的相对表达量均显著高于对照，说明ABA可以诱导ZEP基因的表达。本试验研究表明，外源喷施钨酸钠后，白菜型冬油菜叶片和根中的ZEP基因表达受到抑制，相对表达量显著低于对照。

ZEP是一种双功能单加氧酶，也是ABA合成途径中的调控酶之一，属于脂质运载蛋白家族[28]，主要定位到叶绿体类囊体膜和外被膜上[29-30]。本试验成功克隆了白菜型冬油菜的ZEP基因，包含2 013 bp的开放阅读框，编码含670个氨基酸残基的蛋白质，预测蛋白质分子量为74.03kDa，理论等电点(pI)为6.16，包含FAD-binding 3结构域及FHA结构域，这些结果与甘蓝型油菜和紫花苜蓿中的研究相似[31-32]。ZEP不仅是ABA间接合成过程中的作用酶，也是叶黄素循环中的关键酶。本试验从白菜型冬油菜陇油7号和天油4号中成功克隆出ZEP基因序列，与拟南芥、甘蓝型油菜等进行比对，发现其同源性分别为89.70%和99.40%。经qPCR分析发现，ZEP基因在白菜型冬油菜叶片和根系中均有表达，与烟草ABA2、番茄NpZEP的表达模式相似，叶片中的表达量最高，根系表达量较少[12,33]。且干旱胁迫下，叶片和根系中均有表达，说明ZEP基因在白菜型冬油菜抗旱中发挥作用。