血站核酸检测实验室HBV DNA项目室内质量控制方法探讨

文良雪， 张澜艺， 苏 丽， 王明芬， 刘永生

（遵义市中心血站，贵州 遵义 563000）

进行室内质量控制（internal quality control，IQC）是实验室有效运行的需要，也是《血站实验室质量管理规范》[1]等我国医疗卫生行业相关规定的强制要求。在实时进行实验监控的同时，还应定期对结果进行汇总和回顾性分析，以确保IQC的有效运行。目前，我国血站血液筛查核酸检测实验室均各自采用不同的IQC方案，未见统一标准。为建立适合本实验室的HBV DNA检测IQC方法，本研究在日常使用阳性质控品判定实验是否在控的基础上，结合阳性质控品循环域值（cycle threshold，Ct）、阳性对照Ct值、内标Ct均值、内标Ct值标准差的Levey-Jenning质控图、总体监控指标进行回顾性分析。

1 材料和方法

1.1 标本来源

收集遵义市2018年4月1日— 6月29日无偿献血者酶联免疫吸附试验非反应性血液标本14 172份。

1.2 仪器与试剂

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）DNA阳性质控品（1.0 mL/支，浓度200 IU/mL，批号20171106，北京康彻思坦公司），HBV、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（I型）核酸检测试剂盒[聚合酶链反应（polymerase chain reaciton，PCR）荧光法，含阴、阳性对照，批号20171213，上海科华公司]，Microlab STAR全自动样本处理仪（瑞士HAMILTON公司），ABI 7500实时荧光PCR扩增仪（美国ABI公司）。

1.3 方法

采用8份标本混检模式，按照试剂盒说明书的操作步骤进行每日核酸检测。每批实验均含1个阳性质控品、1个阳性对照和1个阴性对照。当HBV DNA阳性质控品、试剂盒阳性对照为反应性，试剂盒阴性对照为阴性，且内标阳性时，判定该批实验在控。

1.4 绘制Levey-Jenning质控图

在ABI 7500实时荧光PCR扩增系统中查得每批实验的阳性质控品Ct值、阳性对照Ct值、内标Ct均值、内标Ct值标准差。以前20次检测的数据为基准，用SPSS 18.0软件绘制箱型图进行离群值检验（剔除超过3s的数据），分别计算数据的均值、标准差和变异系数，用Excel 2007软件绘制Levey-Jenning质控图。

1.5 回顾性分析

将前20次检测以后每批次的实验结果进行正态分布检验，用Excel 2007软件把数据自动绘入Levey-Jenning质控图，使用Westgard多规则质控方法进行判断。

1.6 总体监控指标分析

统计3个月的检测标本总数及混样反应性、拆分反应性次数，并计算总体监控指标：混检阳性率（混样反应性次数/标本总数×100）、拆分阳性率（拆分反应性次数/标本总数×100）、拆出率（拆分反应性次数/混样反应性次数×100）。

1.7 统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。

2 结果

2.1 实验在控判定结果

3个月的检测数据中，每个批次实验HBV DNA阳性质控品、试剂盒阳性对照及阴性对照均符合判定规则，所有批次实验均在控。

2.2 Levey-Jenning质控图绘制

统计ABI 7500实时荧光PCR系统中的实验数据，计算其均值、标准差和变异系数。绘制箱型图进行离群值检验，均值未出现离群值。绘制Levey-Jenning质控图。见表1、图1～图4。

表1 前20次实验均值、标准差、变异系数统计表

图1 阳性质控品Ct值Levey-Jenning质控图

图2 阳性对照Ct值Levey-Jenning质控图

图3 内标Ct均值Levey-Jenning质控图

图4 内标Ct值标准差Levey-Jenning质控图

2.3 回顾性分析结果

所有结果均服从正态分布，计算所有实验累积均值、标准差、变异系数。见表2。

表2 累积均值、标准差、变异系数统计表

把前20次实验后每批次的实验数据自动绘入Levey-Jenning质控图，得到3个月的Levey-Jenning质控图，使用Westgard多规则质控方法进行判断，阳性质控品在第1、21、31天发生12s警告，第32天发生13s失控，第34天违背41s规则，第28～38天违背规则，见图5。阳性对照在第17、19、35、40、42、44、46、48、50、60天发生12s警告，见图6。内标Ct均值在第26、54天发生12s警告，第30、58天发生13s失控，见图7。内标Ct值标准差在第2、26、30、57天发生12s警告，第27天发生22s失控，第58天发生R4s失控，见图8。

图5 阳性质控品Levey-Jenning质控图

图6 阳性对照Levey-Jenning质控图

图7 内标Ct均值Levey-Jenning质控图

图8 内标Ct值标准差Levey-Jenning质控图

2.4 总体监控指标分析结果

3个月共检测标本14 172份，其中HBV DNA混样反应性13次，拆分反应性8次，混检阳性率、拆分阳性率和拆出率分别为0.092%、0.056%、61.540%。

3 讨论

《血站技术操作规程（2019版）》[2]要求每批核酸检测应至少有1个外部质控品，外部质控品由第三方提供，建议浓度为检测系统最低检测限的2～5倍。科华系统8混检模式HBV DNA检测最低检测限为50 IU/mL。本实验室选择的质控品浓度为200 IU/mL，阳性对照为试剂盒阳性对照，设立质控品和阳性对照的意义在于排除假阴性和进行实验监控，两者不可相互替代；阴性对照可以排除假阳性。内标与靶标DNA在同一反应体系中同时进行核酸提取和扩增检测，可以验证实验过程的可靠性，监测其中是否存在PCR反应的抑制物、降解核酸的酶或影响扩增反应的杂质等。质控品、阳性对照结果为反应性，阴性对照为阴性，且内标有效扩增，则认为该批实验在控。在实时监控进行IQC的同时，观察质控品、阳性对照、内标Ct值波动情况，进行回顾性分析，监控实验性能，发现批间变异，可反映实验的有效性和稳定性。

本研究质控品和阳性对照Ct值变异系数分别为2.41%、0.49%，表示批间稳定性较高，测定结果较一致。将质控品和阳性对照Ct值联合内标Ct值进行分析，结果可显示反应体系对靶标核酸检测值高低的影响。内标Ct均值反映了批内实验稳定性集中趋势，该值在29.89附近波动，且变异系数为0.70%，离散趋势小。内标Ct标准差的变异系数为17.96%，说明批间存在一定的变异，应严格监控核酸检测的实验过程，采取适时进行仪器维护与保养、按说明书要求贮存和使用试剂、控制实验室温湿度、使用不间断电源等措施，控制实验条件，保证实验精密度和准确度。

实验数据正态分布验证结果显示其服从正态分布，可采用Levey-Jenning质控图及相应的质控规则进行IQC。Levey-Jenning质控图可以直观地显示数据的分布，易于发现保存和使用过程中试剂性能的衰减情况（质控品和阳性对照检测值是否呈现连续走低趋势等）及试剂批号更改对实验的影响等。本研究使用同一批号的检测试剂盒，该试剂盒性能良好，并未出现衰减趋势。

Westgard多规则质控方法12s作为警告规则，对误差检出具有灵敏度高的特点，但识别特异性相对较低。因此触发12s警告规则后，应及时启用13s→22s→R4s→41s→规则进行检验，13s和R4s规则可判定是否为随机误差，22s、41s、规则判定是否为系统误差[2]。实验中发生的12s警告，按Westgard“13s→22s→R4s→41s→”规则依次检验，未发生失控。质控品Ct值在第32天测定值超出x-3s控制线，违背13s规则，分析其原因，可能为质控品复融没有在室温条件下放置足够长的时间导致了浓度不均、上样前震荡混匀不充分等，但该批实验阴、阳性对照和质控品均有效，该批检测结果是可接受的；第28～38天违反41s和规则，均在的下侧，实验有效，但警告应对系统进行一定的维护；内标Ct均值在第30、58天超出+3s控制线，可能存在提取效率降低、提取纯化不够、有检测抑制物的情况，也可能是试剂室温平衡时间不够、磁珠在上机前未充分混匀等所致；内标Ct值标准差在第27天发生22s失控、在第58天违背R4s失控，说明该批次内标Ct值波动较大，原因可能是仪器不稳定、电压波动、环境温度和湿度变化大、扩增仪孔间温度不均匀等。

本研究混检阳性率为0.092%、拆分阳性率为0.056%，反映了血液筛查引入核酸检测检测后的功效，表明核酸检测对于剔除病毒感染早期酶联免疫吸附试验非反应性核酸阳性血液、提高输血安全的价值。本研究拆出率为61.540%，其与核酸检测检测效能有关，可反映核酸检测过程的稳定性[3]。若混检阳性率显著升高，而拆分阳性率、拆出率却有所下降，则提示实验室检测过程中污染风险增高[4]，此时应当回顾排查所有可能导致污染的操作过程，进行实验室环境监测，并进一步评估污染风险。对总体监控指标进行分析发现，与本实验室上一年同期比较（混检阳性率、拆分阳性率、拆出率分别为0.084%、0.040%、46.670%）数据均略有上升；与安徽芜湖市中心血站（拆分阳性率为0.080%、拆出率为65.710%）[5]结果相当，比河南省红十字血液中心（0.035%、34.480%）[6]、江苏淮安市中心血站（0.030%、42.420%）[7]、山东潍坊市中心血站（0.014%、44.400%）[8]略高。可能与献血者人群来源不同、地方病毒流行率不同等有关。

需要指出的是，本研究IQC方法可能并不完全适用于临床PCR实验室。因为采供血单位只需要筛出阳性即可，且出于提高血液安全、把漏检率控制在最小、尽量降低输血传播传染病风险的考虑，采取的检测策略比较激进[9]。而在临床医疗机构中，必须准确定量，尽可能减少假阴性和假阳性，否则会给临床诊治带来负面影响，危及患者安全。临床机构若按此方法，可能会导致临床检验中心和ISO 15189外审专家对IQC开具不合格项。

综上所述，在血站血液筛查日常检测中使用HBV DNA阳性质控品进行IQC实时监控，并定期对阳性质控品Ct值、试剂盒阳性对照Ct值、内标Ct均值、内标Ct值标准差绘制的Levey-Jenning质控图进行回顾性分析，再结合日常检测结果进行总体监控指标的统计分析，观察实验有效性和稳定性，可以有效实施血站HBV DNA检测的IQC，以达到及时采取预防措施或纠正措施进行持续改进的目的。