MALDI-TOF MS直接鉴定血培养阳性病原的临床应用

侯伟伟， 江 涟， 李 冬

（同济大学附属同济医院检验科，上海 200065）

血流感染（bloodstream infection，BSI）是临床常见的严重的全身感染性疾病，死亡率较高[1-2]。血培养是BSI诊断的金标准，快速、准确地确定病原菌信息，及时对症用药是临床治疗BSI的关键。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）彻底打破了传统微生物鉴定的模式，使微生物的快速鉴定成为一种可能。本研究采用质谱联合分离胶离心方法，对报阳血培养样本进行前处理后的快速质谱检测[3]，精简操作步骤，缩短临床获取血培养结果的时间，助力临床快速诊疗。

1 材料和方法

1.1 样本收集

收集同济大学附属同济医院血培养报阳样本682例，同一患者的需氧血培养瓶和厌氧血培养瓶均纳入本次研究。质控菌株及质谱校准参考菌株大肠埃希菌（ATCC 8739）购自上海市临床检验中心。

1.2 主要仪器与试剂

质谱仪、Vitek 2 Compact自动化鉴定药敏仪（法国生物梅里埃公司）；Bactec FX全自动血培养仪（美国BD公司），血琼脂平板（美国Thermo公司）；甲酸、乙腈（美国Sigma Aldrich公司）；Bactec血培养树脂需氧瓶、含溶血素厌氧瓶、10 mL一次性无菌注射器、无菌Eppendorf管及分离胶采血管（美国BD公司）；基因组DNA提取试剂盒及聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）相关试剂[生工生物工程（上海）有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 常规染色镜检和转种培养鉴定 将血培养瓶颠倒混匀，用无菌注射器抽取培养液涂片，行革兰染色镜检。若镜下未见细菌，结合培养结果等排除假阳性可能。用无菌注射器抽取培养液接种于血琼脂平板/厌氧血琼脂平板，孵育18～24 h后挑取菌落，进行质谱鉴定；同时制备菌液，选取鉴定卡，采用Vitek 2 Compact自动化鉴定药敏仪（简称自动化鉴定药敏仪）鉴定。

1.3.2 血培养报阳样本质谱直接鉴定（快速质谱法） （1）样本前处理。将血培养瓶颠倒混匀，用无菌注射器抽取培养液4 mL，注入分离胶采血管，常温2 070×g离心10 min，离心后大部分细胞成分及杂质离心至下层分离胶，细菌富集至分离胶上层灰白色沉淀（取少量涂片后行染色镜检，确认有细菌富集），去掉上清液，吸取800 μL无菌0.9%氯化钠溶液至分离胶管，反复轻轻地吹打上层灰白色沉淀，吹打混匀后吸取至Eppendof管，切忌用力吹打分离胶，避免混入分离胶，影响质谱谱峰导致最终结果错误。将Eppendorf管于室温环境2 070×g离心5 min，弃去上清液，加入500 μL 0.9%氯化钠溶液，混匀，2 070×g离心2 min，弃去上清液，留沉淀。（2）甲酸/非甲酸处理。未加甲酸、乙腈的处理方法用于除镜检结果为真菌的血培养阳性样本，取Eppendorf管中沉淀物直接进行质谱鉴定，此方法耗时20 min；加甲酸、乙腈的处理方法用于所有的样本，在Eppendorf管沉淀物中加入70%的甲酸20 μL，吹打混匀后室温放置2 min，加入乙腈，吹打后2 070×g离心2 min，取上清液待用，此方法耗时25 min。（3）质谱鉴定。用无菌枪头轻轻挑取Eppendorf管中少量灰白色沉淀，均匀涂布于一次性靶板的样品孔，加1 μL基质液，干燥后采用质谱仪进行鉴定。以上所有操作均在生物安全柜内进行。

1.3.3 判读标准 在培养菌落后进行质谱鉴定和自动化鉴定药敏仪鉴定结果一致的情况下，用培养菌落后进行质谱鉴定结果为标准评估快速质谱法鉴定结果的准确性；若两者鉴定结果不一致，或无法鉴定，或鉴定到属而无法具体到种的情况，则进行16SrDNA基因测序复核，以此为对照标准。

1.3.4 结果分析 若快速质谱法鉴定到种或属，且病原菌鉴定结果与评判标准结果一致，则表明快速质谱法鉴定结果准确；若病原菌鉴定结果与评判标准结果不一致，则认为鉴定结果不准确。计算快速质谱法鉴定准确率、错误率及无法鉴定率。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，计数资料以率或例表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 质谱鉴定与自动化鉴定药敏仪鉴定结果比较

对682例血培养阳性样本同时进行质谱鉴定与自动化鉴定药敏仪鉴定，在2种方法均可鉴定的情况下，鉴定（种或属）结果符合率为100%。部分菌种（非发酵棒状杆菌5株，地衣芽胞杆菌、短小芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、产黏棒状杆菌各2株，干燥棒状杆菌、污染伯克霍尔德菌各1株）存在质谱可鉴定、自动化鉴定药敏仪无法鉴定的情况，质谱鉴定结果与基因测序结果一致。

2.2 快速质谱法对单数菌的检测结果

682例血培养阳性样本中，664例检出单数菌，539例（81.2%）快速质谱方法可准确鉴定（种/属），122（18.4%）例未鉴定出（种/属），仅3例（0.5%）鉴定错误（种/属），分别为泛菌属、肺炎克雷伯菌和头状葡萄球菌。

以培养菌落后质谱鉴定结果为标准，快速质谱法革兰阴性菌、革兰阳性菌、真菌鉴定准确率（种/属）分别为85.8%/6.0%、65.0%/3.1%、63.6%/0；革兰阴性菌鉴定准确率显著高于革兰阳性菌（P＜0.05）和真菌（P＜0.05），革兰阳性菌和真菌间则无明显差异。革兰阴性菌中，快速质谱法肠杆菌科、非发酵菌、其他革兰阴性菌鉴定准确率（种/属）分别为89.0%/5.0%、65.0%/10.0%、66.7%/22.2%，肠杆菌科的鉴定准确率高于非发酵菌，差异具有统计学意义（P＜0.05），其他革兰阴性菌差异无统计学意义。革兰阳性菌中，快速质谱法葡萄球菌属、肠球菌属、链球菌属、其他革兰阳性菌鉴定准确率（种/属）分别为70.9%/1.1%、71.4%/2.4%、40.5%/10.8%、50%/7.1%，其中葡萄球菌属和肠球菌属的鉴定准确率均高于链球菌属，差异具有统计学意义（P＜0.05），其他革兰阳性菌差异均无统计学意义。快速质谱法鉴定准确率居前3位的细菌分别为肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌，分别为92.8%，96.3%和79.5%。见表1。

表1 664例单数菌快速质谱法鉴定和培养菌落后质谱鉴定结果比较 株

2.3 快速质谱法对复数菌的检测结果

682例血培养阳性样本中，有18例培养出2种细菌，快速质谱法从其中14例中检出菌株，其中13例鉴定出1种细菌，鉴定准确率（种）为77.8%。培养菌落后质谱鉴定和快速质谱法鉴定结果见表2。

表2 快速质谱法14例血培养样本复数菌检出结果

2.4 甲酸处理对阳性血培养样本快速质谱法鉴定结果的影响

664例检出单数菌的样本中，有11例检出真菌。未检出菌的653例样本中，未加甲酸、乙腈处理和加甲酸、乙腈处理的样本，快速质谱法分别检出488株细菌和532株细菌，未加甲酸、乙腈组细菌的检出率显著低于加甲酸、乙腈组，差异具有统计学意义（χ2=8.278，P＜0.05）。加甲酸、乙腈对一部分菌种是有影响的，受影响最明显的是凝固酶阴性葡萄球菌（15例），以下依次为链球菌（8例）、肠球菌（5例）、棒状杆菌属（3例）、金黄色葡萄球菌（3例）等。

3 讨论

MALDI-TOF MS凭借高通量的鉴定系统和足够强大的数据库定义了一种新的微生物鉴定方法，其最大的有点是简单、快速、准确、高效。众所周知，BSI是严重危及患者生命的全身性感染性疾病，BSI病原学诊断的金标准是血培养。那么，如何应用质谱技术实现临床血培养报阳样本的直接快速检测，并在临床实验室常规使用，是临床微生物实验室提高检测效率的重点。

血培养瓶中的成分，除了细菌之外，还存在血细胞及液体等，为了尽可能地避免各种成分的干扰，本研究采用操作比较简单的分离胶离心法[4]，同时考虑到临床微生物室常规操作的可行性及血培养样本直接鉴定结果的高效性，进行了几处细节的改进：（1）分离胶管富集离心采用临床微生物常规配备的普通离心机（2 070×g）获取细菌沉淀物；（2）经过简单的洗涤（2次0.9%氯化钠溶液）和小转速离心（2 070×g）后进行质谱鉴定，因为常规临床微生物实验室并不一定会配备高速离心机，这样更便于常规微生物室操作；（3）关键步骤即分离胶管富集离心后菌体富集物（灰白色沉淀）的挑取，我们未直接采用文献曾报道的直接刮取的方法[4]，而是用吸管取800 μL无菌0.9%氯化钠溶液进行反复吹打，吹打混匀后吸至Eppendorf管，获取菌体富集物，此吹打混匀的方法有效地避免了分离胶的混入，提升了最终细菌沉淀物的纯度，由于该步骤变化前后的比对研究只是前期试做了几例，并未进行大样本的比对研究，因此能否提高鉴定的准确性仍需进一步的研究。本研究结果表明，细菌可鉴定准确率与文献报道[5]比较相近。

在本研究纳入的682例临床血培养阳性样本中，培养菌落后同时进行质谱鉴定与自动化鉴定药敏仪鉴定，其中15例质谱可鉴定而自动化鉴定药敏仪无法鉴定。在2种方法均可鉴定的情况下，鉴定（种或属）结果符合率为100%。

本研究通过与金标准“血培养”病原菌鉴定结果的比较，评估快速质谱法对血液样本中细菌的鉴定能力，发现682例血培养阳性样本中，有664例检出单数菌，快速质谱法可准确鉴定（种/属）的概率为81.2%，与其他文献报道[5]接近，未鉴定出（种/属）的概率为18.4%，错误鉴定概率非常低，仅为0.5%。快速质谱法未鉴定出或鉴定错误的原因可能有以下几方面：（1）血培养样本中细菌浓度低，难以鉴定；（2）血培养样本中细菌细胞壁难以被破坏；（3）血培养直接快速鉴定的操作过程中受其他细胞成分、分离胶及有形杂质等的干扰，如错误鉴定的泛菌属和肺炎克雷伯菌属于黏液型菌株，黏液层可能会影响蛋白的提取，干扰质谱鉴定的结果。

本研究结果表明，快速质谱法准确鉴定革兰阴性菌的概率远高于革兰阳性菌和真菌，原因可能为[6]：（1）革兰阳性菌、真菌的细胞壁较革兰阴性菌厚，细胞壁更难被破坏，导致可准确鉴定的概率低于革兰阴性菌；（2）在纳入本研究血培养的细菌中，革兰阳性菌被污染的概率明显高于革兰阴性菌。对患者的病史（BSI的相关临床症状）及降钙素原、C反应蛋白等感染相关指标进行查询，并对同时送检的其他血培养报阳情况进行追溯，从而判断血流病原菌污染或感染的可能，发现污染菌由于本身菌量比较少，且许多菌种存在细胞壁比较厚的特征，导致血培养快速质谱法鉴定准确率低。本研究快速质谱法可鉴定准确率居前3位的常见致病菌分别为肺炎克雷伯菌（92.8%）、大肠埃希菌（96.3%）和金黄色葡萄球菌（79.5%）。

有学者认为MALDI-TOF MS不适宜作复数菌鉴定[7]，这与本研究结果一致。本研究快速质谱法仅对1例样本准确鉴定出复数菌，其他13例均鉴定出其中1种，可能与复数菌之间浓度差异较大有关。有学者认为复数菌可否分开鉴定的关键取决于不同菌量的比例，为MALDI-TOF MS鉴定复合菌的研究提供了新思路[8]。

本研究结果表明，甲酸、乙腈处理对一部分菌种的鉴定结果有影响，44株只有样本经甲酸、乙腈处理才鉴定出的菌株中，革兰阳性菌占86.4%（38株）、革兰阴性菌占13.6%（6株），这可能与革兰阳性菌本身的细胞壁成分有关，破壁比较困难而无法获得足够量蛋白，需要甲酸、乙腈破壁处理。

总之，快速质谱法与传统仪器鉴定比较优势突出，在临床血培养阳性样本直接检测方面具有更大的优势。质谱仪联合分离胶的简便性及可操作性强，是血培养阳性样本快速检测的一种新的研究方法，并可常规应用于临床微生物检验。对于临床而言，该方法可明显缩短临床获取鉴定结果的时间，为临床的快速诊疗争取时间，从而最大程度地满足临床需求。