NIPT及NIPT-plus在IVF胎儿染色体异常筛查中的应用研究

陆娄恺奕， 仉 英， 陈艺升， 王菲菲， 应春妹

（复旦大学附属妇产科医院，上海 200090）

无创产前基因检测（non-invasive prenatal testing，NIPT）是基于孕妇外周血胎儿游离DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）的无创产前基因检测技术[1-2]。有研究结果显示，该技术可用于检测胎儿21三体（trisomy 21，T21）、18三体（trisomy 18，T18）和13三体（trisomy 13，T13）异常，其对T21的检出率为99.2%，假阳性率为0.09%[3]。

然而仍有约15%的染色体异常不能被NIPT检出，包括罕见常染色体三体、拷贝数变异及胎儿染色体缺失/重复综合征等。NIPT已不能满足临床需求，因此拓展性无创产前基因检测（non-invasive prenatal testing，NIPT-plus）开始在临床被广泛应用。NIPT-plus通过升级现有测序流程及增加测序深度，可检出包括T21、T18、T13、性染色体非整倍体在内的17种胎儿染色体非整倍体、76种＞10 Mb的胎儿染色体大片段缺失/重复综合征，以及相对高发的7种＞3 Mb并位于特定的症候群相关染色体片段位置的微缺失疾病[4]。但是NIPT及NIPT-plus也有局限性，其高风险结果仍需通过侵入性检查（绒毛取样或羊膜穿刺术）进行确认[5]。

《国家卫生计生委办公厅关于规范有序开展孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断工作的通知》[6]要求通过体外受精-胚胎移植（in vitrofertilization-embryo transfer，IVF）方式受孕的孕妇慎用NIPT。而通过IVF受孕的孕妇通常有孕龄偏高、双胎比例大于单胎比例的特征，血清学初筛结果的可靠性不高[7]，作为无法自然怀孕的女性，她们更难以接受有创、侵入性产前诊断，因此确定NIPT及NIPT-plus能否有效应用于这一人群显得尤为重要。

本研究回顾性分析了2017年5月—2019年10月在复旦大学附属妇产科医院进行NIPT、NIPT-plus的IVF受孕孕妇情况，评价NIPT、NIPT-plus应用于IVF受孕孕妇的价值及可能存在的风险。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2017年5月—2019年10月在复旦大学附属妇产科医院进行NIPT、NIPT-plus的孕妇作为研究对象，根据受孕方式不同分为IVF方式受孕（IVF组）及自然受孕（对照组）。其中IVF组1 312例，对照组23 031例。本研究经复旦大学附属妇产科医院医学伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂

NIPT及NIPT-plus试剂盒均购自杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司；检测仪器为美国Illumina公司NextSeq CN500高通量测序仪。

1.3 方法

所有孕妇均按照自愿原则选择NIPT或NIPT-plus进行产前筛查。采集所有孕妇外周血各10 mL并提取cffDNA，采用二代测序技术计算cffDNA相对含量，通过Illumina Sequencing Analysis Viewer 1.9.1软件进行分析。所有NIPT和NIPT-plus结果均提示对高风险孕妇需进行介入性产前诊断并随访。通过归纳整理IVF组及对照组的NIPT、NIPT-plus结果、随访信息和产前诊断结果，结合孕妇孕期的其他数据（孕龄、孕周等），综合分析NIPT、NIPT-plus在IVF胎儿染色体异常筛查中的应用价值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，呈正态分布的计量资料以±s表示，计数资料以例（率）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IVF组和对照组一般情况比较

IVF组孕妇年龄显著高于对照组，孕周显著早于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。IVF组孕妇中双胎妊娠例数显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 IVF组和对照组一般情况比较

2.2 IVF组及对照组NIPT、NIPT-plus结果及产前诊断结果比较

IVF组共检测出T21高风险4例、T13高风险3例、T18高风险0例、性染色体异常高风险17例、拷贝数变异（copy number variation，CNV)高风险3例、其他染色体异常高风险6例。对照组共检测出T21高风险67例、T18高风险26例、T13高风险9例、性染色体异常127例、CNV高风险26例、其他染色体异常30例。见表2。IVF组中有1例13号染色体缺失病例，经产前诊断实际为15号染色体缺失。见表3。

3 讨论

我国是出生缺陷高发国家，随着我国二孩政策的不断推进，高龄产妇比例不断升高，产前筛查对保障母婴健康、提高出生人口素质，具有重要意义。我国传统的产前筛查主要依靠超声联合血清学筛查来完成[8]。血清学筛查包括孕早、中期的唐氏筛查，操作简单、费用较低，但敏感性和特异性有限，且容易受到孕妇年龄、体质量等客观因素的影响[9]。以往血清学筛查提示高风险的孕妇，需进行产前诊断，通常包括绒毛膜穿刺、羊水穿刺和脐血穿刺，均为有创检查，操作复杂，且存在流产风险，孕妇接受度较低[10]。1997年，LO等[1]发现孕妇外周血中存在cffDNA片段，并应用高通量测序技术检测孕妇外周血中cffDNA片段，以评估胎儿常见染色体非整倍体异常风险。NIPT和NIPT-plus采样方便，准确率高，并且孕10周即可采血，有较高的临床应用价值。

在本研究中，IVF组孕妇NIPT、NIPT-plus结果提示高风险概率和产前诊断确诊阳性的概率均显著高于对照组，与以往文献报道基本相符合[7]。IVF组中NIPT、NIPT-plus提示T21高风险结果的阳性预测值和阴性预测值均为100%，有较高的参考价值；而T13和X-异常的阳性预测值在IVF组及对照组中均较低，可能由这2种疾病发病率极低，实验数据偏少所致。有关文献指出NIPT性染色体异常时阳性预测值较低，约占50%[11]，与本研究结果基本一致；将对照组中NIPT、NIPT-plus结果去除X-异常结果后，阳性预测值为40.4%；在IVF组中去除X-异常结果后，阳性预测值为83.33%。这表明在IVF组胎儿性染色体异常的检测中，性染色体三体的高风险结果有较高的参考价值。

在本研究中，NIPT及NIPT-plus提示其他染色体异常高风险时，IVF组有1例NIPT-plus提示10号染色体异常，且该患者孕早期超声检测提示胎儿颈项透明层异常，产前诊断结果为10号染色体异常。这表明在孕早期超声检查存在异常的孕妇中，NIPT及NIPT-plus结果对临床有较高的参考价值。本研究中的NIPT及NIPT-plus对CNV的检测结果不太理想，这可能和实验数据过少有关。有文献报道提出，胎儿颈项透明层厚度及是否合并其他超声异常对染色体数目异常及致病性拷贝数变异均有影响[12]。因此在之后的研究中将结合孕早期超声检测结果及增加标本量完善数据，使结果更有参考意义。

本研究结果显示，NIPT及NIPT-plus在IVF孕妇群体胎儿常染色体三体及性染色体三体筛查中有较高应用价值，性染色体单体及CNV筛查高风险结果具有一定的预警作用，但需要结合临床表现给出合理建议。