大黄酚对局灶性脑缺血再灌注小鼠缺血半暗带区HIF-1α与VEGF表达的影响

房亚兰 杨 楠 赵咏梅* 黄语悠 李锦程 段云霞 高 利 罗玉敏

(1. 北京市平谷区医院全科医疗科，北京 101200； 2. 首都医科大学宣武医院 北京市老年病医疗研究中心，北京 100053)

缺血性脑血管病目前仍是全球范围内的主要死因与长期残疾的主要原因[1]。通过组织纤溶酶原激活剂tPA介导的溶栓和血管内血栓切除术是临床治疗急性缺血性脑血管病的主要有效手段，但却受到狭窄的治疗时间窗的限制，并且缺血后恢复血液供应也可造成再灌注损伤。因此，探索治疗缺血性脑血管病的有效药物具有重大意义。本课题组近年来的研究[2-3]表明，从大黄中提取的主要活性成分之一大黄酚(chrysophanol, CHR)对脑缺血再灌注损伤有神经保护作用，能提高脑缺血小鼠的生存率，减小脑梗死体积，并改善其神经功能评分，且CHR的脑保护作用可持续至再灌注后第14天，说明CHR在防治缺血性脑血管病方面具有潜在的临床应用前景。但CHR对脑缺血再灌注损伤的长期保护作用机制目前尚不完全清楚。

缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)是HIF-1的诱导型调节亚单位。正常情况下，由于泛素蛋白酶体系统的快速降解，HIF-1α极不稳定，HIF-1α蛋白水平非常低甚至很难被检测出来[4]。当组织缺血缺氧时，HIF-1α表达水平升高。HIF-1α在神经损伤中有双刃剑的作用[5]。文献[6]报道，颅脑损伤预后不良患者的血清中HIF-1α水平明显高于预后良好组，HIF-1α的水平变化可作为脑损伤预后的预测指标之一。还有研究[7]显示，新生大鼠脑缺氧缺血可诱导HIF-1α表达，HIF-1α表达的上调可导致神经元凋亡。笔者之前的研究[8]表明，在MCAO大鼠缺血侧的脑组织中HIF-1α表达显著增加，促进脑缺血再灌注损伤。说明HIF-1α表达上调可能是造成缺血性脑损伤中神经元死亡的重要原因之一。研究[9]显示，大黄可通过抑制类风湿关节炎大鼠TNF-α-HIF-1α-iNOS-NO信号通路，减轻炎症反应，从而延缓类风湿关节炎的进展。然而，HIF-1α是否参与CHR的脑保护作用，目前尚无研究报道。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是一种能够促进内皮细胞分裂的特异性有丝分裂原，其与内皮细胞上的受体结合可调节血管通透性、诱导血管的生成与神经修复[10]。VEGF还可直接作用于神经细胞，参与神经元形成及神经功能调节，保护缺血性神经元免受损伤并促进大脑可塑性，发挥神经保护和神经营养作用[11-12]。予以大脑中动脉梗塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)大鼠侧脑室注射miR-377抑制剂或腹腔注射依达拉奉，可显著上调缺血半暗带区VEGF表达，保护半暗带区毛细血管内皮细胞，促进血管生成，从而减轻缺血性脑损伤[13-14]。此外，电针刺激肝俞穴和肾俞穴可促进MCAO大鼠缺血半暗带区VEGF和血小板-内皮细胞黏附分子蛋白表达，改善神经功能缺损[15]。VEGF还可以减少神经元凋亡，提高细胞存活率，减少脑梗死体积，从而减轻脑缺血损伤[16]。

为了探究CHR长期拮抗脑缺血再灌注损伤的作用机制，本项研究应用小鼠制作MCAO再灌注模型，观察CHR对实验小鼠脑缺血再灌注后14 d缺血半暗带区HIF-1α及VEGF表达水平的影响，从而进一步探讨CHR对脑损伤的保护机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备

麻醉机(Harvard Apparatus公司，美国)、手术显微镜(Carl Zeiss公司，德国)、双极电凝器(ACC100,北京德威医疗器械有限公司)、反馈式温度调节仪(CMA 150, Carnegie Medicin公司，瑞典)、冰冻切片机(Thermo Fisher Scientific公司，美国)、荧光显微镜(Nikon公司，日本)。

1.2 试剂

恩氟烷(河北一品制药有限公司)；CHR(中国食品药品检定研究院)；Tween 80(Sigma公司，美国)；HIF-1α抗体(Novus公司，美国)；VEGF抗体(Santa Cruz公司，美国)；NeuN抗体(Millipore公司，美国)等。

1.3 实验动物及分组

18只健康雄性2月龄C57BL小鼠，体质量(23.5±1) g，实验动物许可证号：SCXK(京) 2012-0001(北京维通利华实验动物公司)，饲养于SPF级动物实验室。采用数字表法随机将小鼠分为3组：假手术(Sham)组、MCAO组、CHR组。CHR溶于含1%(体积分数)Tween 80和1%(体积分数)DMSO的0.9%(质量分数)氯化钠注射液(以下简称生理盐水)中，自造模当天开始，CHR组小鼠按0.1 mg/kg[2]腹腔注射CHR，Sham组和MCAO组小鼠腹腔注射同等体积的含1%(体积分数)Tween 80和1%(体积分数)DMSO的生理盐水，每日1次，直至再灌注后14 d。

1.4 动物模型制作

按照改良的ZeaLonga法[8]制备MCAO模型。首先将恩氟烷混合于70%(体积分数)N2O和30%(体积分数)O2中，用5%(体积分数)恩氟烷进行诱导麻醉，再用2%(体积分数)恩氟烷予以维持麻醉。于小鼠颈部的正中线做一纵行切口，分离右侧的颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，将头端直径为0.38 mm的尼龙线栓自颈外动脉残端插入颈内动脉，直至颈外动脉和颈内动脉分叉约1 cm处。手术过程中使用反馈式温度调节仪监测实验小鼠肛温，维持肛温在(37.0±0.5) ℃范围。经缺血45 min后，小心地将线栓拔出进行缺血后再灌注。术后小鼠仍饲养于SPF级动物实验室，自由进食饮水。

1.5 免疫荧光双标染色

于再灌注后14 d，各组小鼠经腹腔注射水合氯醛麻醉后，快速断头取脑，先后于4%(质量分数)多聚甲醛后固定48 h、30%(质量分数)蔗糖脱水24 h，将脑组织按照每片20 μm的厚度进行连续冰冻切片，切片经PBS洗后，用含0.2%(体积分数)TritonX-100的PBS孵育10 min，再经PBS洗后，于室温下用5%(体积分数)山羊血清封闭30 min，滴加一抗(HIF-1α与NeuN抗体1∶300稀释或VEGF与NeuN抗体1∶300稀释)，4 ℃孵育过夜。次日取出切片，经PBS洗后，滴加荧光二抗(1∶300)，避光于室温下孵育1 h。经PBS洗后，最后用含DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)的封片剂进行封片。于荧光显微镜下观察小鼠脑皮质的缺血半暗带区。在相同的放大倍数及参数下，每张脑组织冰冻切片随机选取4个视野照相，使用NIS Element软件统计HIF-1α和VEGF的阳性细胞数目。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 CHR抑制MCAO小鼠脑缺血半暗带区HIF-1α表达

免疫荧光标记结果可见，Sham组小鼠脑组织内偶见HIF-1α红色荧光染色，MCAO组小鼠脑缺血半暗带区内有大量的HIF-1α红色荧光染色阳性细胞，CHR组小鼠脑缺血半暗带区HIF-1α阳性细胞数目比MCAO组明显减少(图1A)，3组间HIF-1α阳性细胞数量差异有统计学意义(P<0.05)。两两比较结果显示，MCAO组HIF-1α阴性细胞数量较Sham组明显增多，CHR组较MCAO组明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05)(图1B)。

图1 免疫荧光双标染色法检测脑缺血再灌注后14 d Sham、MCAO与CHR组小鼠脑缺血半暗带区HIF-1α与NeuN的表达Fig.1 Double labeling immunofluorescent images of HIF-1α and NeuN in cerebral ischemia penumbra of Sham, MCAO and CHR groups 14 d after reperfusion A: Representative double immunofluorescence labeling images of HIF-1α (red)/NeuN (green) on 14 d after ischemia/reperfusion. Scale bar=20 μm. B: Quantification of HIF-1α-positive cells. (n=5, mean±SD) *P<0.05 vs Sham group, #P<0.05 vs MCAO group; MCAO: middle cerebral artery occlusion; CHR: chrysophanol; HIF-1α: hypoxia inducible factor-α; DAPI: 4′,6-diamidino-2-phenylindole.

2.2 CHR促进MCAO小鼠脑缺血半暗带区VEGF表达

免疫荧光标记结果显示，Sham组小鼠脑组织内可见大量的VEGF红色荧光染色阳性细胞，MCAO组小鼠脑缺血半暗带区VEGF阳性细胞数量明显减少，CHR组小鼠脑缺血半暗带区VEGF阳性细胞数目比MCAO组明显增加(图2A)，3组间VEGF阳性细胞数量比较差异有统计学意义(P<0.05)。两两比较结果显示，MCAO组VEGF阳性细胞数量较Sham组明显减少，CHR组较MCAO组明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)(图2B)。

图2 免疫荧光双标染色法检测脑缺血再灌注后14 d Sham、MCAO与CHR组小鼠脑缺血半暗带区VEGF与NeuN的表达Fig.2 Double labeling immunofluorescent images of VEGF and NeuN in cerebral ischemia penumbra of Sham,MCAO and CHR groups 14 d after reperfusion A: Representative double labeling immunofluorescent of VEGF (red)/NeuN (green) on 14 d after ischemia/reperfusion. Scale bar=20 μm. B: Quantification of VEGF-positive cells. (n = 5, mean±SD) *P<0.05 vs Sham group, #P<0.05 vs MCAO group; MCAO: middle cerebral artery occlusion; CHR: chrysophanol; VEGF: vascular endothelial growth factor; DAPI: 4′,6-diamidino-2-phenylindole.

2.3 小鼠脑缺血半暗带区HIF-1α、VEGF分别与NeuN共定位

在MCAO小鼠脑缺血半暗带区内可见HIF-1α阳性细胞及NeuN阳性细胞，其中HIF-1α阳性细胞为红色荧光，NeuN阳性细胞为绿色荧光，细胞核为蓝色荧光(图1A)。图像合并后，红色与绿色荧光能够重合，表明HIF-1α与神经元共定位，即脑缺血再灌注后在缺血半暗带区神经元内有HIF-1α表达。

在CHR组小鼠脑缺血半暗带区内可见VEGF阳性细胞及NeuN阳性细胞，其中VEGF阳性细胞为红色荧光，NeuN阳性细胞为绿色荧光，细胞核为蓝色荧光(图2A)，图像合并后，红色与绿色荧光重合，表明VEGF与神经元共定位，即CHR促进脑缺血小鼠脑神经元内VEGF的表达。

3 讨论

缺血性卒中是一种常见的脑血管疾病，发病率高，是世界范围内严重致残和致死的主要原因之一[17]，目前临床上对脑缺血再灌注损伤的治疗存在各种局限性，用于治疗脑缺血的药物仍不足以显著改善患者预后。因此，有必要为脑缺血再灌注损伤寻找有效的治疗方法。有研究者[18]发现，术前30 min给予大黄酚能改善再灌注24 h大鼠的神经功能评分，减少脑梗死体积。但是CHR在脑缺血再灌注损伤中发挥长期神经保护作用的研究尚少。本课题组前期的研究[3]表明，脑缺血再灌注后14 d，CHR能保护MCAO小鼠的脑缺血损伤，改善脑缺血再灌注小鼠的预后，提示CHR对脑缺血再灌注损伤具有长期的神经保护作用。本团队前期还发现，CHR能减轻内质网应激、下调炎性因子表达[2-3]，并有抑制氧化应激、减少自噬反应的作用[19-20]。然而CHR在脑缺血再灌注损伤中发挥长期神经保护作用的机制目前尚不完全清楚。因此，本研究应用免疫荧光染色法观察MCAO小鼠脑缺血再灌注后14 d缺血半暗带区HIF-1α及VEGF蛋白的表达水平，从而进一步探究CHR发挥长期脑保护作用的机制。

HIF-1α受氧浓度的密切调控。在常氧下，HIF-1α被脯氨酰羟化酶泛素化并降解。在缺氧条件下，HIF-1α与HIF-1β形成二聚体，并激活靶基因的转录。缺氧是缺血性卒中的主要特征。文献[21]报道，HIF-1α的异常表达参与缺血缺氧性疾病的发展过程，脑出血大鼠血清中的HIF-1α水平显著高于正常大鼠。此外，处于高原地区的缺血性脑卒中患者的血清中HIF-1α表达水平明显升高，其表达水平与脑梗死面积大小、脑损伤程度及预后有关[22]。本研究通过免疫荧光染色法观察到在Sham组小鼠的脑组织内中HIF-1α的表达极低，然而MCAO组小鼠脑缺血半暗带区的HIF-1α表达水平明显增多，提示脑缺血再灌注损伤引起HIF-1α表达增加，促进缺血性脑损伤。有文献[23]报道，大黄可以通过下调HIF-1α的水平，降低缺氧/复氧处理后肠上皮细胞的炎症反应，保护肠上皮细胞。本研究的荧光染色结果显示，给予CHR治疗14天的脑缺血再灌注小鼠缺血半暗带区内HIF-1α蛋白表达水平比MCAO组小鼠显著减少，且HIF-1α与NeuN共定位，提示CHR能抑制脑缺血再灌注损伤后神经元内HIF-1α的产生。笔者前期研究[3]证明，CHR能显著降低MCAO小鼠神经元内TUNEL阳性细胞数量。结合本研究结果，进一步提示CHR很可能通过抑制脑缺血再灌注损伤后神经元内HIF-1α的产生，减少神经元的凋亡，发挥神经保护作用。

VEGF参与脑缺血损伤后的能量代谢、血管生成、凋亡和迁移等一系列神经损伤修复过程。研究[24]表明，VEGF可降低神经元对伤害性刺激的反应强度，提高细胞对缺血缺氧损伤的耐受性，进而减少损伤细胞的死亡，并促进神经元生长和发育，发挥细胞保护效应。本研究的免疫荧光染色结果显示，MCAO组小鼠脑缺血半暗带区的VEGF表达水平比Sham组明显减少，提示VEGF的减少可能是造成脑缺血损伤的主要原因之一。研究[25]显示，缺血预处理能够诱导VEGF及其受体的大量表达，对缺血性脑损伤具有保护作用。给脑梗死大鼠注射VEGF能明显促进缺血后损伤神经元的修复[26]，显著减少梗死体积[16]，表明VEGF可改善脑缺血损伤。为了进一步明确CHR拮抗脑缺血再灌注损伤的机制，笔者观察了小鼠脑内VEGF在神经元中的表达。本研究结果表明，给予CHR治疗的脑缺血再灌注小鼠，于再灌注14 d后，其脑缺血半暗带区的VEGF水平比MCAO组小鼠明显增多，且VEGF与NeuN免疫荧光共定位，提示CHR可能通过上调神经元内VEGF表达水平进而发挥长期的神经保护作用。

综上，本研究结果提示，CHR可能通过下调脑缺血再灌注损伤后缺血半暗带区HIF-1α的水平、上调VEGF表达，保护缺血性神经元，从而发挥长期的神经保护作用。本研究进一步丰富了CHR改善脑缺血再灌注损伤的预后、发挥长期脑保护作用的相关机制，为临床应用CHR治疗缺血性脑血管病提供了更多依据。