中国首例乳腺癌患者冻存卵巢组织移植成功报道及文献复习

阮祥燕 杨 瑜 卢 丹 杜 娟 程姣姣 谷牧青 李扬璐 金凤羽 段 微 代荫梅 鞠 蕊 许 新 Matthias Korell Alfred O. Mueck,5

(1. 首都医科大学附属北京妇产医院内分泌科， 北京 100026； 2. 首都医科大学附属北京妇产医院妇科， 北京 100026； 3. 首都医科大学附属北京妇产医院妇科肿瘤科， 北京 100026； 4. 德国诺伊斯约翰娜艾蒂安医院， 诺伊斯 41462, 德国； 5. 德国图宾根大学妇产医院妇女健康部与妇女健康研究中心，图宾根 D-72076， 德国)

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，全球每年约有超过100万人诊断为乳腺癌，中国约占11.2%，仅次于美国(占13.9%)[1]。在我国，年轻乳腺癌患者比例较高，62.9%为绝经前乳腺癌患者[2]。在<40岁的乳腺癌患者中，超过50%的患者会关注乳腺癌治疗后的生育能力并有生育需求，但其妊娠率却不到5%[3]。随着诊断技术与治疗的进步，女性乳腺癌的5年生存率已超过90%[4]，但化学药物治疗(以下简称化疗)、放射治疗(以下简称放疗)与内分泌治疗等会对性腺造成损伤从而导致早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)的发生。POI不仅严重影响乳腺癌幸存患者的生育力，还使得各类慢性疾病如心血管疾病、骨质疏松等疾病发生提前、发病率增加，死亡风险也增加[5]，严重影响肿瘤患者的生活质量。对于乳腺癌幸存患者，如何提高其肿瘤治疗后的生活质量，保护年轻乳腺癌患者的生育能力是临床医生需要重视的问题。

卵巢组织冻存与移植技术利用低温生物学原理使卵巢组织处于休眠状态[6]，待患者肿瘤治疗完成后，再将冻存的卵巢组织复苏移植回体内，从而避免了医源性因素对于卵巢功能的破坏。本文报道1例在首都医科大学附属北京妇产医院进行卵巢组织冻存并移植成功的乳腺癌病例，这是我国首例乳腺癌患者的冻存卵巢组织成功移植。

1 临床资料与方法

1.1 乳腺癌的诊断及手术治疗

患者，女，35岁，孕6产1。2016年9月12日在某医院体检时发现右乳肿物，于北京协和医院进一步诊治，2016年10月8日局部麻醉下行右乳肿物切除活检，术中冰冻病理：(右)乳腺浸润性导管癌，低分化，可见脉管内癌栓；免疫组织化学：雌激素受体α(estogen receptor α，ERα)(-)，孕激素受体(progestone receptor，PR)(-)，Her-2(3+)，ki-67(index 70%)。遂转全身麻醉后行右乳腺癌改良根治术，病理显示：右乳腺组织内可见高级别导管内癌残留，累及乳头下大导管，淋巴结转移癌(腋窝5/25，外侧0/1，第3站0/0，胸肌间0/0)。最后诊断为乳腺浸润性导管癌T1CN2M0期。后续拟行放疗、化疗及靶向治疗。患者无乳腺癌及卵巢癌家族史，未行BRCA-1、BRCA-2基因相关检测。

1.2 卵巢组织取材、转运与冻存

考虑到患者后续拟行化疗，为预防医源性POI并保留生育能力，2016年11月4日患者于首都医科大学附属北京妇产医院内分泌科咨询卵巢组织冻存，抽血结果示(月经第10天)：雌二醇(estradiol，E2)为155.12 pg/mL，孕酮(progesterone，P)为 0.20 ng/mL，卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)为5.93 IU/L，黄体生成素(luteinizing hormone，LH) 为6.23 IU/L，抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH) 为1.26 ng/mL，提示卵巢储备功能尚好，遂决定进行卵巢组织冻存。

2016年11月9日于首都医科大学附属北京妇产医院行腹腔镜下“双侧卵巢部分切除+双卵巢成型术”。术中用冷刀进行双侧卵巢组织取材，卵巢组织切除后立即放入4～8 ℃转移液并在转运箱中保持4～8 ℃恒温，于2 h内转运至首都医科大学附属北京妇产医院的卵巢组织冻存库。此后，对卵巢组织进行如下处理：于4 ℃超净工作台上去除卵巢髓质，将卵巢皮质处理成4 mm×8 mm×1 mm的皮质片，经处理后该患者共冻存卵巢皮质13片。冻存前取直径3 mm 的新鲜卵巢组织行卵泡活性检测：该组织样本中普通光学显微镜下卵泡计数为1个(图1)。另外单独留存两片直径为3 mm的圆形皮质片用于复苏后移植前的卵泡活性检测；另留取相同体积的新鲜皮质片用于病理检测。采用慢速程序化冷冻，具体的冷冻方案、冷冻保护剂参考文献[7]。

1.3 卵巢冻存后的乳腺癌治疗

患者进行卵巢组织冻存后，于2016年11月15日至2017年3月18日进行了化疗。化疗方案如下：ddAC方案(dd:剂量密集型;A:多柔比星;C:环磷酰胺)每2周1次，共4次，吉赛欣支持；后续赫赛汀等治疗1年。2017年4月10日至2017年5月12日进行放疗：常规外照射放疗，用6MV-X线及7、10 Mev-E照射右侧锁骨上下淋巴引流区及右侧胸壁区；Dt 50Gy/25次(常规分割，2 Gy/次，5次/周)。

1.4 卵巢组织复苏与移植

2018年3月26日，患者1年无月经来潮，绝经症状明显，卵巢功能评估：FSH 101.83 IU/L、LH 53.90 IU/L、E2 47.78 pg/mL，AMH<0.06 ng/mL。提示体内留存的卵巢功能彻底衰退。经乳腺肿瘤专家评估后，已处于无瘤存活状态，考虑进行卵巢组织移植。

患者于2018年4月16日，乳腺癌治疗结束1年，在首都医科大学附属北京妇产医院行腹腔镜下冻存卵巢组织移植术。术前2 d复苏2块3 mm直径卵巢组织块进行卵泡数活性检测，每3 mm卵巢组织平均卵泡数9个(图1)，卵泡及组织整体活性很好，可以进行冻存卵巢组织移植。移植日，复苏了6片冻存卵巢组织片，进行了盆腔腹膜袋原位移植。具体复苏过程同文献[7]。移植手术：于右侧骶韧带与右侧输尿管间剪开后腹膜，扩大切口至直径约3.5 cm，腹膜下组织血运良好。将复苏的6片卵巢皮质均匀铺贴于腹膜下创面内，1/0可吸收缝合线8字缝合1针闭合后腹膜创面。

图1 卵巢组织卵泡活性 Fig.1 Follicular activity in ovarian tissue(scale bar=100 μm)A： fresh ovarian tissue under flat-light microscope； B： fresh ovarian tissue under fluorescence microscope； C： frozen-thawed ovarian tissue under flat-light microscope； D： frozen-thawed ovarian tissue under fluorescence microscope; Black arrows represent follicles.

2 治疗结果

2.1 性激素浓度

冻存前患者卵巢功能：FSH 5.93 IU/L、LH 6.23 IU/L、E2 155.12 pg/mL、P 0.20 ng/mL、AMH 1.26 ng/mL，提示卵巢储备功能尚好，遂决定冻存。在结束放疗6个月后复查：FSH升至44.59 IU/L，E2 71.39 pg/mL，AMH<0.06 ng/mL，提示卵巢功能已经衰退，且FSH进一步上升，放疗结束11个月后FSH升至101.83 IU/L。移植后1个月，FSH较移植前下降，为46.53 IU/L；移植后2个月后复查，绝经症状消失，FSH 7.29 IU/L、LH 7.48 IU/L、E2 121.02 pg/mL、P 0.11 ng/mL；移植3个月，患者恢复排卵，月经自然来潮，提示卵巢功能完全恢复正常。现患者已移植近3年，卵巢功能依然正常，且2020年6月3日复查(移植后25个月)提示有排卵：FSH 7.57 IU/L、LH 5.47 IU/L、E2 172.19 pg/mL、P 5.01 ng/mL。患者化疗前至移植后2年的性激素变化见图2。

图2 FSH、E2浓度变化Fig.2 Changes in FSH and E2 levelsFSH：follicle stimulating hormone； E2: estradiol; OTT: ovarian tissue transplantation.

2.2 经阴道超声

2018年3月26日(放化疗结束后，卵巢组织移植前)，患者经阴道超声显示子宫及双侧卵巢呈萎缩状态(图3)；2018年7月13日(移植后3个月)，右侧移植卵巢组织 3.68 cm×2.04 cm，且可见数个小卵泡(图4A)，表明移植的卵巢有卵泡发育；2018年10月10日(移植后6个月)，B超下可见右侧移植卵巢有一1.96 cm×1.56 cm的卵泡，子宫内膜厚度1.21 cm(图4B)，且当天激素浓度提示患者处于排卵前: FSH22.26 IU/L、LH 27.81 IU/L、E2 324.28 pg/mL、P 0.97 ng/mL；2020年6月3日(移植后25个月)B超显示：右侧移植卵巢有一1.84 cm×1.40 cm的黄体(图4C)。当天性激素检测提示患者已排卵：FSH 7.57 IU/L、LH 5.47 IU/L、E2 172.19 pg/mL、P 5.01 ng/mL。表明该患者移植的卵巢中卵泡可以发育成熟并自行排卵。

图3 放化疗结束后，卵巢组织移植前子宫及卵巢B超图像Fig.3 Photographs of uterus and ovary after chemoradiotherapy and before OTTOTT： ovarian tissue transplantation.

图4 卵巢组织移植后B超下卵巢与卵泡图像Fig.4 Photographs of ovaries and follicles under ultrasound after OTTA: several small follicles after 3 months of OTT；B: a 1.96 cm×1.56 cm follicle after 6 months of OTT； C: a 1.84 cm×1.40 cm corpus luteum after 25 months of OTT; OTT： ovarian tissue transplantation.

3 讨论

3.1 乳腺癌治疗对卵巢功能的影响

乳腺癌的治疗除手术切除肿瘤组织外，常常还需要进行放疗、化疗或内分泌治疗。乳腺癌常用的化疗药物包括环磷酰胺、多柔比星、氟尿嘧啶、紫杉醇等[8]，都对卵巢有一定的毒性，尤以环磷酰胺对卵巢的损伤最大，属于高风险类化疗药物[9]。本例患者应用了环磷酰胺、多柔比星进行化疗，导致了POI的发生：FSH化疗前为5.93 IU/L，化疗后FSH最高达到了101.83 IU/L，AMH也降至0.06 ng/mL以下。对于雌激素受体或者孕激素受体阳性的乳腺癌患者，还需进行5～10年的内分泌治疗，即便内分泌治疗的药物没有生殖毒性，患者的卵巢功能也会随着时间逐渐衰退[10]。故有必要对年轻乳腺癌患者进行POI的防治。本例患者由于雌孕激素受体阴性，未进行内分泌治疗，故在乳腺癌结束后1年进行了冻存卵巢组织移植。

3.2 乳腺癌患者现有的生育力保护技术

NICE[11]指南建议：因肿瘤治疗或疾病存在生育力损伤风险时，通过胚胎冻存或卵母细胞冻存以保护生育力。虽然这两项技术目前已成熟，但乳腺癌属于激素依赖性肿瘤，促排卵引起高雌激素浓度会引起体内残留肿瘤细胞快速增生[12]，且促排卵会使肿瘤治疗至少推迟2周[13]。

卵巢组织冻存技术，卵巢组织取材前不需要促排卵，不会导致超生理剂量的雌激素产生[14-16]，因而不会有刺激肿瘤增生的风险。可在月经周期任何时间进行，不延误乳腺癌的治疗。本例患者从卵巢组织取材到乳腺癌化疗，期间仅间隔5 d，未耽误肿瘤的化疗。由于冻存的是卵巢皮质，而非单个卵子，所以卵巢组织冻存为患者保留了巨大的生育潜力的同时还保留了卵巢的内分泌功能[5]。该患者移植前FSH最高达到了101.83 IU/L。移植后1个月FSH便降至46.53 IU/L，移植后2个月卵巢内分泌功能恢复正常：FSH 7.29 IU/L、LH 7.48 IU/L、E2 121.02 pg/mL、P 0.11 ng/mL。从安全性及时间的角度考虑，卵巢组织冻存是乳腺癌患者保护生育力最合适的选择，且只有卵巢组织冻存移植技术可以防治医源性POI。在欧洲，冻存卵巢组织的患者中乳腺癌患者最多，占总体冻存患者的24%[16]。

3.3 移植时机及随访

对于卵巢组织移植的时机，需要待患者原发疾病缓解，发生POI或者有强烈生育要求，距放化疗结束至少3～6个月[5]。对于生育要求的患者，夫妻双方应在移植前排除其他导致不孕的因素[16]。移植后，应对患者进行每月随访，了解其绝经相关症状、月经情况(保留子宫的患者)、实验室内分泌指标(FSH、LH、E2、P、AMH)及B超监测卵泡的发育情况。当卵巢功能恢复正常(绝经相关症状缓解或消失，FSH<25 IU/L)后，可每3～6个月随访1次[5]。研究[16]显示，80%～95%的患者移植后可重新恢复卵巢功能(FSH下降，E2上升)。首都医科大学附属北京妇产医院目前已移植10例，移植后卵巢内分泌功能全部恢复正常[5]。卵巢内分泌功能的恢复大约需要2～6个月，每次移植卵巢功能平均可维持4～7年，最长可达10年。维持时间的长短与卵泡密度、移植的皮质片数量、移植部位等有关。冻存的卵巢组织多者(20片以上)，可以多次移植，总体让卵巢功能维持10～20年以上是可以预期的。

随着乳腺癌患者5年存活率的提高与生育力保护技术的不断进步，传统肿瘤治疗中先保命的理念需要更新，卵巢组织冻存与移植技术在不延误肿瘤治疗的同时也能保留患者的卵巢内分泌功能与生育力，是乳腺癌患者生育力与卵巢功能保护保存的有效方法。