miR-516b-5p靶向ATM调控鼻咽癌细胞HONE1 DNA修复的机制研究

张 勇 张 炜 范崇盛

DNA双链断裂(DSB)是DNA损伤的最危险形式，因为无法修复它们可能导致细胞死亡，基因组不稳定或肿瘤发生[1]。真核细胞中有两种主要的DSB修复途径，即非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)[2]。DSB还激活了1个复杂的信号网络，称为DNA损伤响应(DDR)，它协调DSB的修复和细胞周期检查点的激活[3]。肿瘤是1种具有无限增殖能力的细胞组织[4]。DNA损伤及其修复机制是导致肿瘤形成的重要因素[5]。基于此，本研究使用鼻咽癌细胞HONE1为研究对象，旨在探讨鼻咽癌细胞HONE1中抑制DNA修复的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料

pBABE-dd-I-PpoI购自addgene公司(货号：49052)。他莫昔芬购自sigma公司(货号：T5648-1G)。pDNA-PKcs抗体购自abcam公司(货号：ab32566)。GAPDH抗体购自上海机纯实业有限公司(货号：ml4041550(s))。ATM抗体购自广州市左克生物科技发展有限公司(货号：BF0374-100ul)。鼻咽癌细胞HONE1购自广州一骏生物制品有限公司(货号：JNO-1861-2)。miRNA mimics,miRNA inhibitor,siRNA和ATM过表达质粒均由上海权阳生物提供。Etoposide(ETP)购自深圳市益百顺科技有限公司(货号：Etoposide)。Shield-1购自上海皓元生物医药科技有限公司(货号：HY-112210)。荧光素酶报告质粒pEZX-MT01购自复能基因(货号：CmiT000001-MT05)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染 鼻咽癌细胞HONE1在含有10%胎牛血清的DMEM中培养细胞。miRNA mimics,miRNA inhibitor,siRNA和ATM过表达质粒与转染试剂混合，在室温下静止20 min后，缓缓滴入鼻咽癌细胞HONE1中。使用500 nM Etp,处理鼻咽癌细胞HONE1 48 h。

1.2.2 免疫印迹 用PBS洗涤一次后，将细胞重悬于预冷的RIPA缓冲液(50 mM Tris-HCl，pH 7.4、1 mM EDTA，0.5 mM EGTA，1%Triton-X-100、0.1%萘二酚，0.1%SDS，150 mM NaCl，蛋白酶抑制剂(完全不含Mini EDTA，#4,693,159,001，Roche)和磷酸酶抑制剂，然后超声处理，以14,000 rpm的转速在4离心10 min除去细胞碎片收集上清液，并通过Bradford蛋白质测定法定量蛋白质浓度，将等量的蛋白质上样至SDS-PAGE或Criterion 4%～12%预制凝胶上。电泳时，将蛋白质在4 ℃下转移到硝酸纤维素膜上90 min，然后在室温下将膜与5%脱脂牛奶孵育1 h，然后在4倍于稀释的一抗4 ℃孵育过夜，然后在5%脱脂牛奶中与二抗一起孵育室温下放置1 h。使用蛋白质简单分析仪，使用增强的化学发光(ECL)Western印迹底物进行检测。

1.2.3 RNA抽取与实时荧光定量PCR 用于检测DNA水平的引物序列如下：(SLCO5a1-F-cut：CCCAGTGCTCTGAATGTCAA； SLCO5a1-R-cut：CCATTCATGCGCGTCACTA)。使用GAPDH(GAPDH-F：TCAGCCAGTCCCAGCCCAAG;GAPDH-R：GAGAAAGTAGGGCCCGGCTAC)引物对将DNA水平标准化为实时PCR值。

1.2.4 高通量测序 通过trizol法抽取ETP诱导DNA损伤后的鼻咽癌细胞HONE1总RNA。RNA样品被送到北京基因组研究所进行商业性RNA-Seq服务和数据分析。使用SOAPaligner/SOAP2不匹配，将明确的读段映射到human数据库。计算每个基因读数，然后将其标准化为每百万分之一读数(kbKM)，该读数与基因表达水平相关。利用log2比率来确定基因调控。选择log2比率为-1或log2比率为1的学差异基因进行进一步分析。

1.2.5 基于I-PpoI的可诱导DSB系统 将pBABE-dd-I-PpoI质粒转染至鼻咽癌细胞HONE1中，使用嘌呤霉素筛选稳定细胞株。为了进行DNA切割和修复分析，将Shield-1的以终浓度1 mM添加到细胞中3 h，以稳定dd-I-PpoI，然后再与4 mM 4-OHT一起孵育30 min。 处理后，将药物在PBS中冲洗掉，以便随时间推移进行DNA修复。通过实时PCR进一步定量I-PpoI位点的DNA水平。通过实时PCR分析富集的染色质。引物序列(SLCO5a1F-F：GCATGAATGGATGAACGAGAT；用于实时PCR的SLCO5a1R-F：CAAGCTCAACAGGGTCTTCT)位于200 b.p.的5'上游区域的两侧、切割部位的远端。断裂期间的实时PCR分析用于测量I-PpoI位点的完整性，并将每个样品中的值均以GAPDH标准化。绘制3个独立实验的平均值和SEM。将非同源末端连接因子占用率和每个时间点的输入值归一化为GAPDH。所有数据均以未处理样品的值标准化为1。

1.2.6 荧光素酶报告实验 荧光素酶报告质粒pEZX-MT01包含AMT的野生型或突变型3'UTR。使用荧光素酶报告基因系统分析荧光素酶活性前，将miRNA mimic或阴性对照(NC)和荧光素酶报告基因共转染至鼻咽癌细胞HONE1(1×104)48 h。

1.3 统计学分析

每个实验至少重复3次，结果显示为平均值±标准差(SD)。使用SPSS 19.0进行统计分析。进行双尾t检验以比较组之间的差异。P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 ETP诱导鼻咽癌细胞HONE1 DNA损伤的miRNA表达谱

使用ETP处理鼻咽癌细胞HONE1造成DNA损伤后，通过高通量测序发现ETP处理后hsa-miR-9983-3p,hsa-miR-4731-5p,hsa-miR-3675-5p,hsa-miR-516b-5p,hsa-miR-4437,hsa-miR-7114-5p,hsa-miR-637,hsa-miR-5008-5p的表达水平上升至少8倍。

2.2 miR-516b-5p导致DSB的DNA-PKcs含量减少

可诱导的I-PpoI核酸内切酶系统可在人类基因组中的已知位置切割[6]。他莫昔芬处理并加入Shield-1使鼻咽癌细胞HONE1中的酶稳定，从而诱导了与ER核定位序列融合的I-PpoI核酸内切酶的核定位[7]。通过洗掉他莫昔芬和Shield-1使I-PpoI不稳定并输出到细胞质中，从而使修复得以实现[8]。使用此系统对人类SLCO5A基因中I-PpoI位点的定量PCR分析后发现miR-516b-5p mimics导致DSB的DNA-PKcs含量减少(P<0.05)，而miR-516b-5p inhibitor导致DSB的DNA-PKcs含量增加(P<0.05)，见图1A和图1B。

图1 miR-516b-5p导致DSB的DNA-PKcs含量减少

2.3 miR-516b-5p靶向ATM抑制DNA-PKcs磷酸化水平

通过miRDB在线分析发现miR-516b-5p潜在靶向多种基因。在鼻咽癌细胞HONE1中过表达miR-516b-5p后，发现ATM mRNA的表达水平和蛋白表达水平下降，DNA-PKcs的磷酸化水平下降；而敲低表达miR-516b-5p后，发现ATM mRNA的表达水平和蛋白表达水平上升，DNA-PKcs的磷酸化水平上升。同时，miR-516b-5p靶向ATM的3端非编码区报告基因活性下降。过表达ATM后，DSB的DNA-PKcs含量上升(P<0.05)，而敲低ATM后，DSB的DNA-PKcs含量下降(P<0.05),见图2。

图2 miR-516b-5p靶向ATM抑制DNA-PKcs磷酸化水平

3 讨论

DNA的完整性对于维持基因组的稳定性至关重要，而这对于所有生物的生存和正常运行至关重要[9]。使用DNA作为基于碱基配对的DNA复制的模板是1个严格而精确的事件[10]。但是，DNA容易受到多种因素造成的破坏，例如来自环境或体内的化学致癌物，正常代谢产生的氧化性自由基，端粒缩短，端粒酶活性变化，原癌基因激活，肿瘤抑制基因失活，紫外线(UV)辐射和电离辐射以及许多药品，尤其是遗传毒性抗癌药[11]。自发性损害和环境损害均可导致DNA分子的损坏，包括DNA双链断裂(DSB)[12-13]。

在正常细胞中，大多数DNA损伤可以通过触发众多复杂而精确的调节机制来修复，包括激活细胞周期检查点，启动修复系统以及诱导细胞凋亡[14]。肿瘤是1种具有无限增殖能力的细胞组织，DNA损伤及其修复机制是导致肿瘤形成的重要因素[15]。在癌前病变中，经常会检测到由损伤激活的DNA损伤和DNA损伤修复途径，其中包括ATM，Chk1，Chk2，H2AX，p53和p16等检查点激酶的激活以及DNA标记灶的形成[16]。本研究通过ETP诱导HONE1细胞发生DNA损伤后，发现hsa-miR-9983-3p,hsa-miR-4731-5p,hsa-miR-3675-5p,hsa-miR-516b-5p,hsa-miR-4437,hsa-miR-7114-5p,hsa-miR-637,hsa-miR-5008-5p的表达水平上升至少8倍。尽管仅仅检测到hsa-miR-516b-5p能够抑制DSB中DNA-PKcs的含量，但是其他miRNA是否参与DSB修复的其他功能仍然值得进一步探索。

在本研究中，过表达miR-516b-5p后，ATM mRNA的表达水平和蛋白表达水平下降，DNA-PKcs的磷酸化水平下降；而敲低表达miR-516b-5p后，ATM mRNA的表达水平和蛋白表达水平上升，DNA-PKcs的磷酸化水平上升。过表达ATM后，DSB的DNA-PKcs含量上升(P<0.05)，而敲低ATM后，DSB的DNA-PKcs含量下降(P<0.05)。ATM和DNA-PKcs是磷酸肌醇3激酶样(PIKKs)丝氨酸/苏氨酸激酶[17]。DNA-PKcs和ATM在响应DNA DSB和协调DSB修复的早期就被激活[18]。DNA-PKcs被Ku70和Ku80异二聚体募集并在DSB处激活[19]。 Mre11-Rad50-Nbs1(MRN)复合体在DSB募集并激活了ATM[20]。激活后，ATM在细胞周期的G1期促进NHEJ，而在S/G2促进HR[21]。相反，DNA-PKcs主要在NHEJ的DSB修复中起作用[22]。ATM介导的DNA-PKcs磷酸化，从DNA末端取代了DNA-PKcs，而DNA-PKcs介导的ATM磷酸化抑制了ATM的催化活性[23]。提示ATM和DNA-PKcs能够被募集到相同的DNA末端，它们在彼此之间进行调节。

综上所述，miR-516b-5p通过靶向ATM mRNA的3端非编码区，降解了ATM mRNA，抑制了ATM的翻译，随后DNA-PKcs的磷酸化水平下降，DNA-PKcs与DSB的结合减少，最终抑制了鼻咽癌细胞HONE1的DNA修复。