粮食中黄曲霉毒素B1检测的免疫磁珠法样本前处理应用研究

李红洲，卢红洋，鲍闯业，任迎会，李 岩，刘 津，原晓玲，张 波2，

(1.贵州省产品质量监督检验院，贵州 贵阳 550016； 2.江苏大学环境与安全工程学院，江苏 镇江 212013； 3.沭阳康源泰博生物科技有限公司，江苏 宿迁 223600； 4.招远市温泉街道办事处，山东 烟台 265400)

黄曲霉毒素(aflatoxin,AFT)是一类由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的次生代谢产物的总称。目前已发现的黄曲霉毒素有20多种，其中已分离鉴定出的黄曲霉毒素有B1、B2、G1、G2、M1、M2等18种。因此，准确快速的测量玉米等食品中的黄曲霉毒素含量具有重要的意义[1-5]。我国在2017年颁布的《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》GB 2761—2017中规定，玉米、小麦等谷物及其制品中黄曲霉毒素B1含量的最高限定量为20 μg/kg[6]。

在食品检测分析中，主要有酶联吸附法、胶体金快速定量法、免疫亲和层析净化高效液相色谱法、液相色谱质谱联用等检测方法[7-12]。而样品的前处理富集净化是仪器分析前的重要步骤，由于食品中成分复杂且理化性质各异，会严重干扰目标物质的提取、分离及检测，因此在测定样品中有害物质之前，需进行目标分析物的提取、净化、浓缩等前处理步骤，以达到待测物与干扰杂质分离的目的，从而减少检测时的干扰峰，并能有效富集试样中的痕量待测组分。样品的净化处理是测定真菌毒素的难点所在。目前常用的净化方法主要为免疫亲和柱净化法、固相萃取柱净化法、液液萃取、Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe法(QuEChERS)[13-18]。这些提取方式不仅操作繁琐，效率不高，而且需要大量使用包括正己烷、乙酸乙酯、石油醚等在内的各种有机溶剂，此类有机溶剂易对环境产生二次污染，也会对操作人员的健康产生伤害。

免疫磁珠为磁性微球和免疫配基结合而成的纳米级材料，表面通常带有氨基、羧基、羟基或巯基等化学官能团，该官能团与不同的免疫配基如活性蛋白、抗体、抗原、亲和素、生物素等结合形成免疫磁珠。免疫磁珠已经广泛用于生物样本的提取和处理，如核酸、蛋白的提取等[19-22]。在食品分析中，免疫磁珠净化体系的作用力是外界磁场，磁场纳米颗粒在磁场中可定向运动，从而在反应结束后能利用磁铁实现反应体系和未反应体系的快速分离，整个净化过程在15 min之内，极大地缩短了前处理时间。

本实验采用免疫磁珠净化法实现对样本前处理富集纯化，是将纳米磁珠代替免疫亲和柱的多糖微球跟目标分析物的特异抗体偶联，然后在样品提取液中反应，通过清洗、洗脱等步骤获得净化的、浓缩样品处理液，随后采用高效液相色谱法进行含量测定。对比免疫磁珠净化和免疫亲和柱法(国标法)两种净化方式对玉米、小麦中等样品中黄曲霉毒素B1含量的测定结果的差异，以确定免疫磁珠净化法对样本提取测定的可行性。

1 试验材料与方法

1.1 材料与仪器

Waters2695高效液相色谱仪，美国Waters公司；荧光检测器，美国Waters公司；光化学衍生系统，北京康源泰博生物科技有限公司；KJMR-IIA型血液混匀器，江苏康健医疗用品有限公司；电子天平，梅特勒上海有限公司；TG16-WS台式高速离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；免疫亲和柱，A公司；玻璃纤维滤纸，针头过滤器，玉米、小麦等样品购置于当地超市。

甲醇、乙腈为色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠用分析纯，购置国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1免疫磁珠提取样品中黄曲霉毒素B1

以公司自主研发的全自动免疫磁珠纯化仪为样本净化提取净化设备，称取25 g粉碎的样品与125 ml甲醇-水(7∶3，体积比)溶液混合均匀，加入5.0 g氯化钠用均质器高速搅拌，提取2 min，在离心机上离心5 min(4 000 r/min)，准确移取15 ml滤液并加入30 ml水稀释。取出磁珠液体2 ml，放于试管条的磁珠管位中，将试管条放置于仪器的试管条组件中，在样本管中加入5 ml样本提取液。通过全自动免疫磁珠法纯化仪使磁棒套在磁珠管位、样本管位、清洗管位、洗脱管位来回移动，自动完成样本的富集、清洗、洗脱。样本即提取完成，样本收集液留在收集管中，待HPLC检测用。

1.2.2国标法(免疫亲和柱法)提取样品中的黄曲霉毒素B1

根据GB 5009.22—2016食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定中规定，免疫亲和柱:AFTB1柱容量≥200 ng。

称取25 g粉碎的样品与125 ml甲醇-水(7∶3，体积比)溶液混合均匀，加入5.0 g氯化钠用均质器高速搅拌，提取2 min，离心5 min(4 000 r/min)，准确移取15 ml滤液并加入30 ml水稀释。

首先将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温。将黄曲霉毒素B1免疫亲和柱连接于20.0 ml注射器下，准确移取15.0 ml样品提取稀释液注入注射器，将空气压力泵与注射器连接，调节压力使溶液以约6 ml/min(1～2滴/s)流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2～3 ml空气流入柱体；以10.0 ml水淋洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2～3 ml空气通过柱体，准确加入1.0 ml色谱级甲醇洗脱，流速为1～2 ml/min，收集到的甲醇洗脱液，收集滤液于进样瓶中以备进样

1.3 仪器条件

高效液相检测条件：进样体积为50 μl，柱温30℃，水∶乙腈∶甲醇(体积比)为68∶18∶18，流速为0.8 ml/min。荧光检测：激发波长Ex=360 nm，发射波长Em=450 nm；色谱柱：C18柱(柱长150 mm，柱内径4.6 mm，填料粒径5 μm)，可直接使用HPLC检测。

2 结果与分析

2.1 免疫磁珠法净化高效液相色谱法标准曲线的绘制

以不同质量浓度黄曲霉毒素B1标准溶液为横坐标，对应的峰面积积分值为纵坐标，绘制黄曲霉毒素B1测定的标准工作曲线，见图1。

图1 免疫磁珠法净化高效液相色谱法测定黄曲霉毒素B1含量的标准曲线

其线性方程为：y=184 501x，R2=0.999 8，线性相关系数符合方法要求。

2.2 免疫磁珠法和免疫亲和柱法的高效液相色谱图比较

免疫磁珠法(蓝线)和免疫亲和柱法(红线)的样品净化处理的高效液相色谱图见图2。采用1.2.1节和1.2.2节中的两种方法对黄曲霉毒素B1进行净化分离，从图2中可知，在相同的色谱条件下，两种净化方法处理样品的出峰时间几乎一致，且不存在其它明显干扰杂质峰，表明免疫磁珠法和免疫亲和柱法这两种分离方法对样品进行净化效果良好且效果明显，符合仪器检测分析的样品前处理要求。

图2 免疫磁珠(蓝线)和免疫亲和柱(红线)的样品处理的高效液相色谱图

2.3 免疫磁珠法和国标法(免疫亲和柱法)的实际样品检测结果对比

以玉米、饲料、小麦等粮食为目标检测物，预先采用1.2.1节和1.2.2节中所述的方法步骤对多种样品进行处理富集净化，净化结束后采用高效液相

表1 两种不同前处理方法的检测结果

色谱法对数据进行处理、检测分析。检测结果见表1。表1结果表明两种前处理方法所得的结果相差不大，在合理的检测范围误差内。

2.4 免疫磁珠法的加标回收测试

为了进一步验证免疫磁珠法对实际样品检测的准确度，采用全自动免疫磁珠纯化仪净化法结合高效液相色谱法对添加黄曲霉毒素B1的空白小麦、花生、饲料、辣椒酱等样品进行检测，加入适量配置的黄曲霉毒素B1标准品，使AFB1的添加量分别为2.5、5、10 ng/ml 3个水平浓度，每个水平重复测试5次，计算回收率和相关变异系数。4种样品基质添加回收率结果见表2。

表2 4种基质中黄曲霉毒素B1的加标回收试验(n=5)

从2表中可知，4种基质的平均回收率在88.58%～107.61%，变异系数小于10%。回收率和变异系数均符合残留检测的要求，说明该方法具有较好的准确性和重复性，可以用于天然样品中AFB1的准确定量与分析。

2.5 两种检测方法的比较分析

从检测步骤来看，免疫磁珠法和国标法(免疫亲和法)净化样品中黄曲霉毒素B1时，均需要对样品进行称量、提取、净化、洗脱、进样上机测定，并绘制标准曲线等操作处理。其差异性体现在提取的反应原理上，其中免疫磁珠法主要采用免疫磁珠为固相载体，使免疫反应更接近液相，反应更加充分和快速，免疫磁珠上偶联有抗黄曲霉毒素B1抗体，在反应时形成磁珠-抗原-抗体复合物，结合的免疫复合物更加容易分离，降低了非特异性吸附，更利于全自动仪器应用。而国标法(免疫亲和柱法)主要利用柱子里装载的琼脂糖凝胶上偶联的抗黄曲霉毒素B1抗体，形成载体-抗原-抗体复合物，样品净化时需要外加泵流操作架配备注射器，对样本的流速有要求，过滤过程相对缓慢，且不易实现自动的仪器操作。因而在对大批量的样品检测时，可以采用免疫磁珠法进行样本的预处理、富集净化待测组分。

3 结论

在仪器法定量检测分析之前，与免疫亲和柱净化法相比，样品的前处理可采用以免疫磁珠法为原理的直接提取净化，无需经过免疫亲和柱的净化富集，也可以满足实验测定的要求。全自动免疫磁珠纯化仪净化法具有处理快速，实验成本低，而且易于自动化操作，解放了实验人员双手，适合企业以及检验机构初检筛选或者新手操作。通过多次试验，使用全自动免疫磁珠纯化仪进行净化处理的结果准确度高、精密度好，处理方法净化时间短。此外采用全自动式进行净化处理，无需人员看守，检验人员可同时完成其他工作，从而提高工作效率；在保障检验人员安全方面，通过平台全自动进行净化处理，检验人员避免了直接接触阳性样品并减少了直接接触有机试剂的机会，从而使检验人员的身体安全得到了保障。