千里光过氧化氢酶基因序列特征与功能的生物信息学分析

左青青，钱 露，闻伟锷，徐德林，刘朝波，钱 刚，李 林

(1.遵义医科大学 细胞生物学教研室，贵州 遵义 563099；2.遵义医科大学 第一临床学院，贵州 遵义 563099)

过氧化氢酶(CAT)是植物重要的抗氧化酶类，能清除氧自由基，有效调节机体H2O2含量。在植物应对逆境胁迫、抗病等相关研究中，CAT被认为是响应胁迫与抗逆、抗病能力水平的重要指标酶。王宏等检测接种黑斑病菌的4种梨发现，抗病品种翠冠和苏翠1号梨中CAT活性显著升高，较感病品种华酥、七月酥CAT活性降低，表明CAT参与梨黑斑病的抗病防御反应[1]。近年来更是在多种植物中证实，该酶引入或表达水平提高对于增强植物多种抗逆能力具有重要作用。在烟草中转入大肠杆菌CAT基因，发现转入过氧化氢酶基因的烟草对除草剂的抗性增强[2-3]，同时植物的抗病能力也显著增加[4]。对中药材的研究表明，CAT抗氧化活性与清除自由基是中药材重要的药理作用。李超等通过Morris水迷宫实验，对正常组老鼠和碘缺乏组老鼠同时使用黄芪和黄芪发酵制剂，观察老鼠的记忆功能，结果显示碘缺乏小鼠较正常小鼠出现明显的记忆障碍，发现碘缺乏老鼠的海马组织中CAT活性明显降低，表明黄芪对老鼠的海马组织的氧化损伤具有保护作用[5]。因此，对于常用中药材中CAT的研究不仅有利于其抗逆能力的解析，也有益于药用成分、药理作用的研究，具有重要的现实意义。

千里光(SenecioscandensBuch.-Ham.Ex D.Don)又名九英里，菊科(Compositae)，千里光属，多年生攀援草本植物，是我国应用历史悠久的传统中草药[6]。千里光始载于《本草拾遗》，性寒、微苦，具有清热解毒、杀虫、明目、凉血、生肌、驱风除湿等功效，其药理学作用集中体现在抗菌[7]、抗病毒[8]、抗钩端螺旋体、抗滴虫[9]、抗氧化[10]及清除自由基活性[11]等方面。目前有关过氧化氢酶基因结构、功能的报道很多，但在菊科千里光属植物鲜见报道。本研究采用多种生物信息学分析方法，对千里光过氧化氢酶功能与蛋白结构进行预测，为千里光抗氧化活性等方面的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 植物材料为采自于贵州遵义地区的野生千里光。

1.2 千里光转录组数据库的构建 采取千里光新鲜叶片，采用TRIzol法提取Total RNA，SMART方法构建千里光全长cDNA文库[12]，随机挑选阳性克隆进行测序(华大基因完成)，所得clean reads经Trinity软件进行从头组装，去冗余等得到千里光转录组数据库。

1.3 生物信息学分析千里光CAT序列 根据测序得到的核苷酸序列运用NCBI的ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)分析核苷酸序列的开放阅读框；采用ExpasyProt Param(https://web.expasy.org/protparam)分析过氧化氢酶的分子量、等电点、氨基酸组成、不稳定系数; 利用 ProtScale(https://web.expasy.org/protscale)在线软件预测千里光CAT蛋白亲水疏水性；用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr)预测过氧化氢酶的二级结构，并用软件SWISS MODEL(http://swissmodel.expasy.org/repository)建立三维结构; 使用在线软件Pfam(http://pfam.xfam.org/search/sequence)预测其蛋白质功能结构域，应用在线工具PSORT Ⅱ Prediction(https://psort.hgc.jp/cgi-bin/runpsort.pl)预测过氧化氢酶核苷酸序列的亚细胞定位；通过Signalp 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测该酶中是否存在信号肽；利用NET PHOT3.1(https://www.cbs.dtu.dk/services/netphos/)及NetOGlyc 4.0server(https://www.cbs.dtu.dk/services/netOGlyc/)预测该酶的磷酸化位点及糖基化位点；运用DNAMAN(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)进行多物种氨基酸序列比对，并使用MEGA6.0软件的邻接法(Neighbo-joining)构建多物种的系统发生树。

2 结果

2.1 千里光过氧化氢酶理化性质特征与亲疏水性分析 千里光过氧化氢酶基因的序列全长为1 521 bp，ORF finder查找开放阅读结果显示该序列全长1 521 bp，共编码506个氨基酸；使用ExpasyProt Param 软件预测显示千里光过氧化氢酶由20种氨基酸组成，其中Ala和 Thr含量最高，占比27.5%、28.1%，其次是Cys和Gly，分别占比23.1%、21.4%，不含Pyl和Sec；该蛋白分子量为127,644.42 Da，理论等电点(pI)为4.98，原子组成为C4665H7811N1521O1949S351，带负电荷残基总数(Asp+Glu)：0，带正电残基总数(Arg+Lys)：0；该酶的半衰期4.4 h；不稳定系数为48.56，表明该蛋白质结构不稳定，属于不稳定蛋白(根据不稳定系数>40以上属于不稳定蛋白)。

在线软件ProtScale预测千里光cat基因序列的亲水性和疏水性，负值越大代表亲水性越强，正值越大代表疏水性越强，结果显示千里光CAT的亲水性氨基酸明显多于疏水性氨基酸(见图1)。

数值超过0表示氨基酸为疏水性氨基酸，不超过0表示氨基酸为亲水性氨基酸。

2.2 千里光CAT二级与三维结构预测 二级结构与三维结构对酶发挥生物学功能具有重要作用。本研究利用SOPMA软件分析千里光过氧化氢酶的二、三级结构，结果表明该酶主要的结构元件是α-螺旋和无规则卷曲，其中256个氨基酸残基(50.59%)为无规则卷曲结构(Random coil),是最大量的结构原件，133个氨基酸残基(26.28%)为α-螺旋结构(Al-pha helix)，86个氨基酸残基(占17%)为线性结构(Extended strand)，31个氨基酸残基(占6.13%)为β-转角(Beta turn),见图2。从分布位点上来看，C端和N端均含有α-螺旋，无规则卷曲贯穿整个蛋白质，而延伸链和β-转角则散布于整个蛋白质中。利用软件SWISS MODEL对千里光CAT建模，可知该酶结构错综复杂，螺旋结构、无规则卷曲占据整个三维结构的主要部分，与二级结构中无规则卷曲结构占主要结构的结果相符(见图3)。

蓝色代表α-螺旋结构，绿色代表β-转角，紫色代表无规则卷曲结构，红色代表线性结构。

图3 千里光CAT三级结构

2.3 千里光CAT结构域与信号肽的预测 结构域是蛋白质生理功能的结构基础，是功能活性的中心部位。利用在线工具Pfam预测千里光过氧化氢酶氨基酸序列结构域，结果显示过氧化氢酶结构域位于第32个氨基酸残基到第411个氨基酸残基之间。Signalp 5.0 server预测千里光过氧化氢酶的信号肽结果显示，该酶显示不含信号肽(见图4)，表明它是由游离的核糖体合成后进入胞质溶胶的蛋白质。

图4 千里光CAT信号肽预测

2.4 千里光CAT的亚细胞定位、磷酸化位点及糖基化位点 不同的亚细胞定位决定了植物不同的特异的生物学功能。采用PSORT Ⅱ对千里光CAT的亚细胞定位进行预测，结果显示CAT在细胞质机率占52.2%，在细胞核中占26.1%，在线粒体中占17.4%，在细胞支架上仅占4.3%，表明该酶主要存在于细胞质中。

磷酸化和糖基化作用是调节蛋白质功能的重要实现方式，几乎植物整个生命活动中均有这两种方式的参与。在蛋白质翻译合成中，磷酸化和糖基化具有重要修饰作用，其中丝氨酸、苏氨酸、络氨酸是磷酸化的主要结合位点。通过NetPhot 3.0及NetoGlyc 4.0对磷酸化位点及糖基化位点预测，结果显示千里光CAT磷酸化位点有67个，其中丝氨酸(Ser)磷酸化位点有18个，分值占0.942，苏氨酸(Thr)有7个磷酸化位点，分值占0.921，络氨酸(Tyr)42个磷酸化位点，分值占0.885(见表1)；糖基化位点有156个。

表1 千里光CAT磷酸化位点检测

2.5 千里光CAT氨基酸序列同源性分析 运用DNAMAN软件将千里光CAT氨基酸序列与唐松草、泽兰、菜蓟、艾菊、山茶花、可可粉、山扁桃变种、向日葵、苹果、枇杷、海岛棉、烟草、野茶树、榴莲、芝麻、加州丁香树等33个物种氨基酸序列进行比对，发现大多数物种间的CAT氨基酸序列的相似度高，在图5中显示黑色和红色区域(>75%)占多数，表明千里光过氧化氢酶与33个物种的过氧化氢酶的氨基酸序列有较高的同源性(>96%)，进一步表明过氧化氢酶基因在不同物种中具有较高的保守性，具有重要的生物学功能。

XP_024989449.1 山扁桃变种、XP_021976738.1 向日葵、XP_028960187.1 苹果、AGC65520.1 枇杷、KAA3467156.1 海岛棉、XP_019244886.1 烟草、XP_028076166.1 野茶树、XP_022769370.1 榴莲、XP_011074092.1 芝麻、AZL93846.1 加州丁香树、GEX71529.1 艾菊、XP02489450.1 菜蓟、QBC35994.1 大丁草、KAD2804630.1 泽兰、PIA46782.1 耧斗菜、KAE8731430.1木槿、XP022849681.1木犀榄、RAL43212.1 菟丝子、GAV6348.1土瓶草、AAC19397.1水晶花烛、KAB2632020.1刺柏、OMO52152.1 黄麻、XP031374233.1 石榴、XP028098144.1 山菜花、QFE96863.1 芹菜、XP028767778.1 牧豆杉、PQQ11386.1 樱花、XP034675968.1 葡萄、QKX94683.1 胡杨、NP001310800.1 枣、AUT36476.1 白薯、PSS00391.1 红豆杉、KAF5180005.1 唐松草、SSb CAT千里光。不同背景颜色表示序列同源性大小：黑色100%，红色75%，蓝色25%，白色0。

2.6 千里光CAT的系统进化分析 为了深入了解千里光CAT与33个物种CAT之间的进化关系，利用MEGA软件将千里光CAT与33个物种采用邻接法构建千里光CAT蛋白序列的进化树，如图6所示。所选34种植物均可聚为2个大分支，其中千里光与唐松草、菜蓟、向日葵、大丁草、艾菊的过氧化氢酶属同一分支，表明千里光在进化关系上与这些物种亲缘关系较近；与丁香树、枣的分支距离最远，表明进化上亲缘关系较远。其中向日葵、艾草、菜蓟、大丁草为菊科植物，与千里光又分属于不同亚支，表明在进化上千里光与其他菊科植物间有较远的进化关系。

图6 千里光与其他33种植物的CAT系统进化树分析

3 讨论

过氧化氢酶是植物体内清除氧自由基的重要清除剂[13]，也被认为是植物体抗氧化系统关键酶。尽管关于过氧化氢酶基因序列的报道众多，但是在菊科植物中关于过氧化氢酶的蛋白结构与功能关系的却鲜有报道。本文利用生物信息学的方法分析CAT的理化性质和结构域，发现该酶共编码506个氨基酸，结构域在第32个氨基酸到第411个氨基酸之间。从长度以及结构域的氨基酸序列上看，各物种间较为保守。34份材料间比对序列相似度>75%(显示黑色和红色区域)占多数，从相似度计算结果来看为96%以上，从而表明CAT是植物具有高度保守性的酶类。结合二级结构和三级结构分析，千里光CAT符合Catalase like家族的典型特征，由4个相同肽链亚基组成的四聚体血红素酶，是过氧化氢发挥作用的活性位点和铁血红蛋白的结合位点。在进化关系上，分析千里光与山扁桃、菜蓟等34个物种构建系统发育树表明，千里光CAT与艾菊、向日葵等4种菊科植物归于一支，表明该酶在进化地位上与其分类学一致。但与这4种菊科植物的进化关系进一步比较则表明千里光CAT归于不同亚支，表明该酶的进化关系远与其他4种菊科植物。

对白菜[14]、藜麦[15]等多种植物的的抗病、抗逆过程的分析表明，CAT响应多种信号分子如SA、白斑病、盐胁迫，参与植物重要的生命活动过程。而磷酸化与糖基化是蛋白质功能调节的重要方式，对千里光CAT磷酸化与糖基化位点的分析表明，其存在丰富的磷酸化位点(67个)和糖基化位点(156个)，可能是其参与多个信号通路，应对植物多种逆境胁迫的重要基础。

本研究通过对千里光过氧化氢酶基因的结构与功能分析，近缘物种的进化关系比较为千里光重要的药理作用抗氧化活性的形成与评价，进一步开发与利用等研究奠定了基础。