二甲双胍对2型糖尿病大鼠视网膜病变和细胞焦亡的影响及机制研究

周 群，石 婷

(南京医科大学附属南京医院 南京市第一医院 药学部，江苏 南京 210006)

2型糖尿病(Type 2 diabetes)是指胰岛素相对缺乏，患者主要由于胰岛素分泌不足或耐受导致血糖升高，并且具有多饮、多尿、多食、体重降低这一典型的“三多一少”症状，是目前临床最常见的慢性病及基础疾病之一，随着我国人口老龄化与生活方式的变化，发病率逐年增高[1]。糖尿病患病率从1980年的0.67%飙升至2013年的10.4%，我国糖尿病以2型糖尿病为主，1型糖尿病及其他类型糖尿病少见[2]。糖尿病的各种慢性并发症是糖尿病患者残疾、致死的最重要原因，糖尿病慢性并发症中以糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy，DR)致残率最高，但目前临床上缺乏其无创的筛查方法[3]。糖尿病视网膜病变作为糖尿病患者常见的眼部并发症，是工作年龄段人群中常见的致盲原因，我国糖尿病人群中DR的患病率为25.0%～43.1%，而其发病是环境因素和遗传因素共同作用的结果，高血糖、高血压和糖尿病长病程是促进糖尿病视网膜病变重要的环境因素[4]。二甲双胍是双胍类降糖药，也是首选用于单纯饮食控制及体育锻炼治疗无效的、特别是肥胖的2型糖尿病一线和首选的口服药物，早期研究认为二甲双胍可以通过活化AMP依赖的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)降低肝糖原的生成、提高周围组织对葡萄糖的利用度来降低血糖，近年研究发现，二甲双胍具有多重效应，如减少糖尿病患者大血管和微血管的并发症以及肿瘤的发生率[5]。二甲双胍广泛应用于2型糖尿病不仅是因为对血糖控制作用良好，而且其对糖尿病视网膜病变患者的微血管和大血管并发症具有较好的保护作用，国内外均有报道，二甲双胍联合传统中药或其他药物可减轻糖尿病视网膜病变程度[6-7]。

弗氏、志贺氏杆菌诱导巨噬细胞时可观察到细胞发生程序性死亡，伴有细胞膜完整性丧失、细胞内容物释放及炎症反应，这些表现与已知细胞凋亡结果不同，这种死亡方式由半胱氨酸蛋白酶 1(Caspase-1)介导，而非传统的 Caspase-3 介导，2001年首次提出“Pyroptosis”一词来形容该类在巨噬细胞中发现的依托Caspase-1、伴随炎症反应发生的细胞死亡方式，称之为“细胞焦亡”[8]。糖尿病视网膜病变的发病机制与多种炎症性疾病相似，包括细胞焦亡在内的炎症机制可能是糖尿病视网膜病变的中心环节之一，高血糖通过细胞焦亡或自噬等生物过程引起炎性反应从而导致血管和视网膜组织损伤[9]。但目前二甲双胍对糖尿病视网膜病变的改善作用的机制报道较少，本研究将在2型糖尿病视网膜病变大鼠中探讨二甲双胍对细胞焦亡的影响。

1 材料与方法

1.1 构建模型 选取4周龄的雄性Wistar大鼠90只，随机选取30只给与标准饲料喂养，设为对照组。取60只大鼠设为实验组给与高脂饲料(10%猪油；20%蔗糖；1.0%胆汁酸；2.5%胆固醇；66.5%标准饮食)，1周后实验组腹腔注射30 mg/kg的STZ，对照组腹腔注射同等剂量的溶剂，连续注射1周以构建高血糖模型[10]。实验组继续高脂高糖饮食喂养1个月，至大鼠出现高血糖、胰岛素抵抗则认为2型糖尿病模型构建成功。2型糖尿病模型构建成功后，实验组继续高脂高糖饮食喂养1个月，直至出现视网膜病变，则2型糖尿病视网膜病变模型构建成功。将实验组随机、平均分为模型组与二甲双胍组。

1.2 模型评价 高血糖模型：以空腹血糖≥11.1 mmol/L判定模型构建成功；2型糖尿病模型：禁食一晚后测量空腹血糖及空腹胰岛素，并进行葡萄糖耐量检测量试验，空腹血糖≥11.1 mmol/L及出现胰岛素抵抗为2型糖尿病模型构建成功[10]。2型糖尿病视网膜病变模型：随机取6只大鼠，取双眼视网膜，进行HE染色，大鼠视网膜出现相关病变症状即为构建成功。

1.3 分组 本次实验共选取90只雄性Wistar大鼠，其中30只设为对照组，给予标准饮食，每天以等量的溶剂(1%羧甲基纤维素)灌胃；模型组共27只，给予高脂高糖饮食，每天以等量的溶剂(1%羧甲基纤维素)灌胃；二甲双胍组共27只，给与高脂高糖饮食，每天以300 mg/kg二甲双胍(溶剂为1%羧甲基纤维素)灌胃[11]。干预实验进行2个月。

1.4 观察指标 每日测量大鼠体重，观察是否存在死亡情况。尾静脉采血后检测甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血糖水平。

1.5 伊文思蓝试验 配制30 mg/mL伊文思蓝溶液(Sigma)并用微孔滤膜过滤。干预结束后，以45 mg/kg的伊文思蓝尾静脉注射入大鼠体内，2 h后取大鼠眼球制备视网膜铺片并在荧光显微镜下观察。以上操作均需避光。

1.6 HE染色 取大鼠视网膜组织并制成石蜡切片。切片经高温及不同浓度的乙醇脱蜡至水后，用苏木素染液(碧云天)染色3 min，快速将切片置入清水中终止染色。以1%盐酸浸泡切片0.5 min后蒸馏水中荡洗切片，用1%氨水浸泡切片0.5 min使蓝色复染后洗涤切片。用伊红染液(碧云天)浸泡切片2 min。以中性树脂封片后镜下观察。

1.7 Western blot实验 提取视网膜组织总蛋白并制备蛋白样品；制备不同浓度的SDS-PAGE胶，样品在胶中电泳以分离不同分子量大小的蛋白；在恒流条件下将胶中蛋白转移至PVDF膜中，完成后用5%牛奶封闭2 h。在4度条件下，孵育一抗过夜(NLRP3：Proteintech，19771-1-AP；Caspase-1：Proteintech，22915-1-AP)。以5%牛奶配制辣根过氧化物酶标记二抗，37℃孵育1 h；加入化学发光显影液并拍照。

1.8 实时荧光定量PCR实验 提取大鼠视网膜组织总RNA，根据逆转录试剂盒(南京诺唯赞)将各组RNA逆转录生成cDNA并进行扩增。

1.9 电镜 取视网膜组织加入4%戊二醛溶液并将样品置于4 ℃冰箱中过夜。弃去上清并洗涤后，用1%的锇酸固定2 h。洗涤后将样品用酒精脱水后加入丙酮，静置。将样品逐步包埋后静置1 d。样品切片后，用 3 %醋酸铀-柠檬酸铅进行染色并在电镜下观察。

2 结果

2.1 二甲双胍对体重、血糖的影响 二甲双胍治疗2型糖尿病伴视网膜病变大鼠2个月后，检测体重、空腹血糖和空腹胰岛素的变化。通过表1，相对于对照组，模型组和二甲双胍组大鼠体重显著下降，但二甲双胍组体重相对于模型组较高；模型组与二甲双胍组大鼠空腹血糖和胰岛素水平均高于对照组，经二甲双胍治疗后，均显著下降。

表1 各组大鼠体重、血糖及胰岛素水平对比(n=30)

2.2 二甲双胍对生化指标的影响 经二甲双胍治疗后，大鼠血清生化指标的变化。2型糖尿病伴视网膜病变大鼠总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平较对照组升高，但经二甲双胍治疗后，显著降低；相对于对照组，模型组和二甲双胍组大鼠高密度脂蛋白显著下降，但二甲双胍组水平相对于模型组较高(见表2)。

表2 各组大鼠体重、血糖及胰岛素水平对比(n=30)

2.3 二甲双胍对视网膜病变的影响 如图1A所示，对照组大鼠视网膜血管形态正常，红色荧光染料均匀分布于血管中，边缘清晰且无渗漏；模型组大鼠视网膜背景荧光增强，出现明显的渗漏点，出现明显的血管扩张现象；经二甲双胍治疗的大鼠，渗漏点相对于模型组显著减少，血管扩张现象较轻。如图1B所示，对照组大鼠视网膜层次清晰，排列整齐，未出现毛细血管病变；模型组大鼠视网膜各层变厚且排列紊乱，视网膜外存在萎缩现象；而二甲双胍组视网膜外层清晰，未见萎缩现象。经以上实验，二甲双胍可以明显改善2型糖尿病视网膜病变大鼠的血管扩张现象。

A：用伊文思蓝试验观察各组视网膜血管渗漏情况；B：HE染色在200倍镜下观察各组大鼠视网膜病变情况；每组均随机选取6个样本进行实验。

2.4 二甲双胍对细胞焦亡的影响 NLRP3(Pryrin 结构域蛋白3，nod-like receptor protein 3)和Caspase-1均为细胞焦亡的标志性蛋白。在模型组大鼠视网膜组织中，NLRP3和Caspase-1蛋白与mRNA水平均显著升高，而经二甲双胍治疗后，明显下降。以上结果表明，二甲双胍能够改善视网膜组织细胞的焦亡现象。

A：Western Blot实验检测二甲双胍作用后各组视网膜组织中NLRP3和Caspase-1蛋白表达情况；B：实时荧光定量 PCR实验检测二甲双胍作用后各组视网膜组织中NLRP3和Caspase-1的mRNA表达情况；*：与对照组相比，P<0.05；#：与模型组相比，P<0.05。每组均随机选取6个样本进行实验。

3 讨论

糖尿病确切的病因和发病机制尚未完全阐明，对糖尿病的治疗已成为需要全人类共同攻克的难题，2型糖尿病发展至后期会产生严重的并发症，如糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病足等[12]。长期高血糖状态容易使管壁周细胞减少，视网膜内屏障遭到破坏，导致视网膜出血、渗出等症状，毛细血管基底膜增厚，血液循环受阻，视网膜缺血、缺氧，从而产生一系列增殖性改变，因此，有效控制血糖能够有效降低糖尿病发病率的同时也能有效降低糖尿病患者视网膜病变的致盲率[13]。众多因素对其发生发展过程产生影响。陈雪等[14-15]发现，收缩压和脉压变异性是影响2型糖尿病患者伴发视网膜病变的危险因素，但甲状腺功能减退与其发病无关。通过分析2型糖尿病视网膜病变患者与健康人群脉络膜血管指数的差异及特点，发现脉络膜血管指数可以直观反映其内部结构的变化并且在健康人群中较高，具有较高的诊断意义[16]。二甲双胍作为常见的治疗糖尿病药物，常与其它药物联合在糖尿病视网膜病变的治疗中发挥重要作用。王化湘等[17]发现，二甲双胍联合抗血管内皮生长因子药物治疗糖尿病视网膜病变,能够有效改善患者视力状况。张哲等[18]研究中，联合应用二甲双胍与抗血管内皮生长因子药物较单纯使用更能改善糖尿病视网膜病变情况，能抑制血管内皮生长因子所诱导的的视网膜血管内皮细胞增生及迁移，其作用机制可能与二甲双胍抑制血管内皮生长因子的表达有关。二甲双胍联合骨化三醇对2型糖尿病患者视网膜具有一定保护作用，并且临床不良反应较小,安全性较高[19]。在机制方面，YI等发现可降低血管内皮生长因子受体2的磷酸化水平抑制VEGF信号转导过程[20]。并且二甲双胍可能通过诱导microRNA-497a-5p的水平，从而导致视网膜新生血管减少[21]。在本研究中，二甲双胍治疗2型糖尿病视网膜病变大鼠后，降低模型组大鼠的血糖、血脂等相关生化指标，并且显著改善了视网膜病变情况。

焦亡作为一种细胞死亡的方式，其主要特征为细胞膜孔的快速形成，从而导致细胞内炎症物质的释放和细胞破裂[22]。二甲双胍不仅作为糖尿病治疗的一线用药，同时也具有直接的抗炎作用[23]。魏红霞等[24]发现，二甲双胍增强脂多糖激活的腹腔巨噬细胞在ATP(腺嘌呤核苷三磷酸，Adenosine-triphosphate)刺激下的炎症小体活化,提高caspase-1活化和成熟白细胞介素-1β释放，促进炎症反应。在糖尿病视网膜病变的研究中，Sirpa等[25]研究发现NLRP3炎性体在非增殖期糖尿病视网膜病变中是激活状态。另外，在糖尿病视网膜病变患者的手术切除的增殖膜中，观察到NLRP3、caspase-1和白细胞介素-1β表达增高，表明以上蛋白可能与病程的发生发展有关[26]。本研究发现，在糖尿病视网膜病变大鼠模型中，NLRP3、caspase-1表达升高，但经二甲双胍治疗后，显著降低。

本研究主要发现了二甲双胍能够显著改善糖尿病大鼠视网膜病变情况，其与减少细胞焦亡水平有关，但其二甲双胍影响细胞焦亡的具体机制尚需进一步研究。