基于网络药理学的蓝芩口服液治疗新型冠状病毒肺炎的分子机制研究

李研达，曾煜，刘旺

1.湛江市中心人民医院内科，广东 湛江524000；2.广东医科大学附属第二医院呼吸与危重症医学科，广东 湛江524000

新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)简称“新冠肺炎”，在全球范围内爆发[1]。COVID-19被证实为一种主要经飞沫或接触传播的急性呼吸道传染病，其具有潜伏期长、传染性强、人群普遍易感的特点[2]。虽然目前我国疫情已明显好转，确诊病例增长脚步明显放缓，但近期在多地仍有少数本土确诊病例被报道。国外疫情防控形势相比较于我国更加严峻，尤其是美国、巴西等欧美国家，确诊病例仍迅速增长，其中意大利和西班牙的新冠肺炎总体死亡率更是超过10%，新冠肺炎已成为严重影响人类健康的社会问题。目前我国发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》指出，目前尚无针对新冠肺炎的特效药物[3]，但中医中药凭借其在疾病中辨证论治方面的特点，不论是在以往的非典型肺炎还是如今我国防控新冠肺炎疫情方面都起到了重要的作用。

蓝芩口服液是由板蓝根、黄柏、黄芩、胖大海、栀子等中药组合而成的中药制剂，由于其具有抗病毒、清热解毒、消炎止痛等作用，目前已在临床上被广泛应用于治疗上呼吸道感染、慢性咽炎等多种疾病中[3]。《广东省新型冠状病毒肺炎中医药治疗方案(试行第二版)》推荐蓝芩口服液用于疑似病例及早期确诊病例的治疗[4]。板蓝根具有清热解毒、消炎利肿的功效，能在体内阻断病毒复制和繁殖，具有明确的抗病毒功能[5]。黄柏味苦、性寒，有清热、燥湿、解毒、疗疮之功，并且对包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌在内的多种细菌有抑制作用[3]。黄芩味苦、性寒，有泻火、解毒、止血、安胎之功效，可在体内抑制腺病毒及流感病毒的复制及播散[6]。胖大海味甘、性凉，现代药理学表明其具有抗病毒、抗炎症反应、抑制细菌繁殖的作用，并且可增强脾脏及胸腺的功能，参与调节机体的免疫功能[7]。栀子味苦、性寒，有清热、泻火、凉血之功效，在抑制炎症渗出、抗金黄色葡萄球菌、镇痛等多个方面均发挥作用[8]。

网络药理学是在传统药理学的基础上整合计算机网络科学、分子生物学等多个学科的一门新兴学科，其主要强调药物对疾病网络的干预，从整体上探索药物与机体之间的相互作用关系，反映了多组分、多靶点和系统调控的思想，与中医中药的辨证论治和整体观念有着相似之处[9]。本研究拟通过网络药理学探索蓝芩口服液治疗COVID-19的分子机制，为COVID-19治疗药物的研发和临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 蓝芩口服液主要活性成分筛选TCMSP(http://tcmspw.com/index.php)是一个可用于探索药物、靶标和疾病之间的关系的中草药系统药理数据库[10]。使用TCMSP数据库，以蓝芩口服液的主要5味中药药材板蓝根、黄柏、黄芩、胖大海、栀子为关键词，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18及半衰期(half-Life，HF)≥4为筛选标准，筛选蓝芩口服液的主要活性成分。

1.2 蓝芩口服液主要活性成分作用基因靶点及COVID-19相关基因靶点收集Related Targets功能是TCMSP数据库的功能之一，可用于预测得到的蓝芩口服液的主要活性成分的作用靶点信息，使用Uniprot(https://www.uniprot.org/)数据库对活性成分作用靶点信息进行校正及标准化得到对应的基因靶点[11]。使用GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库[12]，以“Novel coronavirus pneumonia”为检索词，检索得到新型冠状病毒肺炎的相关基因靶点。对蓝芩口服液主要活性成分作用基因靶点及疾病相关基因靶点使用韦恩图取交集得到共同基因靶点，此共同基因靶点即为蓝芩口服液治疗COVID-19的基因靶点。

1.3 药材-活性成分-作用靶点网络与共同基因靶点蛋白相互作用网络的构建 将板蓝根、黄柏、黄芩、胖大海、栀子这五味中药与其主要活性成分及相关作用靶点信息导入Cytoscpe 3.7.2(http://www.cytoscape.org/)[13]软件中，构建药材-活性成分-作用靶点网络。将“1.2”中韦恩图得到的共同基因靶点导入STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins，https://string-db.org/)[14]数据库，设置物种为“Homo sapiens”，构建共同基因靶点的蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络。

1.4 共同基因靶点GO与KEGG通路富集分析DAVID数据库是对基因功能进行注释的常用数据库，使用DAVID(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery，https://david.ncifcrf.gov/)[15]数据库，设定物种为“Homo sapiens”，对共同基因靶点进行基因本体论(Gene Ontology,GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，以P＜0.01和富集的基因counts＞5为截断值标准，以进一步了解蓝芩口服液治疗COVID-19的分子信号通路。GO分析由三个方面组成，分别是生物学过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)，是对基因的本质进行阐述。KEGG通路富集分析有助于了解某一基因或者某一蛋白质所参与信号通路过程及其在信号通路过程中所处的地位。

2 结果

2.1 蓝芩口服液的主要活性化合物 本研究通过TCMSP数据库，以OB≥30%、DL≥0.18及HL≥4为筛选标准，共筛选得到蓝芩口服液的主要活性成分104种，其中板蓝根30种，黄柏27种，黄芩32种，胖大海4种，栀子11种，去除重复项后共得到91种主要活性成分。各活性成分以OB值按大小排序，使用表格对OB值排名前20的活性成分进行展示，如表1所示。

2.2 蓝芩口服液主要活性成分作用靶点及疾病相关靶点 使用TCMSP数据库对蓝芩口服液主要活性成分的作用靶点进行预测，经过Uniprot数据库对相关作用靶点信息进行标准化和基因名称注释及去除重复值后，共得到205个作用基因靶点，其中作用靶点数目排名前5的活性成分分别为MOL000098-quercetin(槲皮素)、MOL000358-beta-sitosterol(β-谷甾醇)、MOL000449-Stigmasterol(豆甾醇)、MOL000422-kaempferol(山奈酚)、MOL000173-wogonin(汉黄芩素)。新冠肺炎相关基因靶点信息通过使用Gene Cards数据库，以“Novel coronavirus pneumonia”为检索词检索得到，共得到疾病相关基因靶点259个。使用韦恩图将活性成分作用基因靶点与COVID-19相关基因靶点取交集后得到共同基因靶点43个即为蓝芩口服液治疗COVID-19的基因靶点，如图1所示。

图1 蓝芩口服液治疗COVID-19基因靶点韦恩图

2.3 构建靶点相互作用网络 使用Cytoscape

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3.7.2 软件对板蓝根、黄柏、黄芩、胖大海、栀子这五味中药药材及其活性成分、作用靶点构建药材-活性成分-作用靶点网络，该网络包含282个节点和1272条边(5个中药药材节点，74个活性成分节点，205个基因靶点节点)，其中黄色三角形代表板蓝根(Isatidis Radix)、黄柏(Phellodendri Chinrnsis Cortex)、黄芩(Scutellariae Radix)、胖大海(Sterculiae Lychnophorae Semen)、栀子(Gardeniae Fructus)这五味中药药材，绿色六边形代表各中药药材所对应的主要活性成分，蓝色圆形代表五味中药药材的共同活性成分，红色菱形代表205个基因靶点(图2)。使用STRING数据库，对“2.2”中得到的蓝芩口服液治疗COVID-19的基因靶点构建PPI网络(图3)，PPI网络中共包含43个节点和513条边，每个节点代表靶点蛋白，每条边代表靶点蛋白与其他靶点蛋白间的相互作用关系。度值可反应某个靶点蛋白与其他靶点蛋白相互作用关系的强弱从而提示靶点在网络中的地位，在PPI网络中，度值排名前10的靶点分别为：丝裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)、白介素6(interleukin 6，IL6)、胱天蛋白酶3(Caspase 3，CASP3)、白介素10(interleukin 10，IL10)、丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、CXC趋 化 因 子 配 体8(C-X-C motif chemokine ligand，CXCL8)、CC型修饰趋化因子配体2(CC chemokine ligand 2，CCL2)、白介素1B(interleukin 1B，IL1B)、前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)、干扰素γ(Interferon-gamma，IFNG)，蓝芩口服液很有可能通过作用于这些靶点在治疗COVID-19中发挥作用。

2.4 共同基因靶点的功能富集分析 本研究中使用DAVID数据库对基因靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，以P＜0.01和富集的基因counts＞5为截断值标准，对GO每个富集项目中富集基因数目排名前5的注释条目使用柱状图进行可视化(图4)，对KEGG通路富集分析中富集基因数目排名前20的注释条目使用柱状图进行可视化(图5)。GO富集分析显示，共同基因靶点在生物学过程、细胞组分和分子功能这三个方面富集的条目分别是30、10、7，其中包括了炎症反应、药物反应、免疫反应、凋亡过程、蛋白质结合、转录因子结合、酶的结合等多个方面，提示蓝芩口服液可能通过参与多个生物学途径的调节对COVID-19的治疗产生影响。KEGG通路富集分析显示共同基因靶点富集在包括癌症通路、缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)信号通路、Toll样受体信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路在内的59个KEGG信号通路。

图2 蓝芩口服液中药材-活性成分-作用基因靶点网络

图3 蓝芩口服液蓝芩口服液治疗COVID-19靶点蛋白相互作用网络

图4 蓝芩口服液治疗COVID-19基因靶点GO富集分析

图5 蓝芩口服液治疗COVID-19基因靶点KEGG通路富集分析

3 讨论

COVID-19因具有潜伏期长、传染性强、传播迅猛的特点，在中医学中归属于“疫病”范畴[3]。自古以来我国对于疫病的病因、病机、防控及治疗等方面有着较为完善的理论体系，一代代医家学者在通过不断探索与实践，在疫病诊疗的各个方面都积累了丰富的经验。有临床研究表明，中西医结合治疗COVID-19能减轻患者的临床症状，缩短疾病病程，提高治愈率的特点[16]。

在《广东省新型冠状病毒肺炎中医药治疗方案(试行第二版)》中，对于新冠肺炎的病因病机，可总结为以肺为病变之重心，可辐射至脾、肾、胃等多个器官，其病机特点为热、湿、瘀、毒、虚，在该方案中蓝芩口服液被推荐用于以外感发热为主要症状的疑似病例及以乏力、咽痛、口干、干咳少痰等为主要临床表现的早期确诊病例中[3]。因此，本研究试图通过网络药理学进一步挖掘蓝芩口服液的主要活性成分及其在治疗COVID-19中的分子机制。

本研究应用网络药理学的方法，共筛选出蓝芩口服液中主要活性成分91种以及相对应的作用基因靶点205个，其中作用靶点数目排名前5的活性成分分别为槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、山奈酚、汉黄芩素。槲皮素是一种黄酮类化合物，现代药理学表明，槲皮素在抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤及降糖、降脂等多个方面均有重要作用[17]。研究发现，槲皮素可抑制包括IL6、IL10、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在内的多种炎症介质的产生，同时还可通过钙稳态途径抑制巨噬细胞中炎症因子的释放，从而在炎症反应中发挥作用[18]。汉黄芩素也是一种黄酮类化合物，在体内补体系统的过度激活中有着抑制作用，对于甲型流感病毒所致的急性肺损伤具有改善作用[19]。研究表明β-谷甾醇在抗病毒、抗炎、免疫调节等多方面具有重要作用，还可以通过抑制TNF-α-NF-κB信号通路起到改善肝脏纤维化、保护肝功能的作用[20]。山奈酚同样是一种具有抗炎、抗菌、抗病毒等多种功效的黄酮类化合物，在抗菌、抗病毒方面，有研究报道了山奈酚对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)、霍乱弧菌、乙型肝炎病毒均有抑制作用，同时亦可通过抑制炎症因子的表达发挥着抗炎症反应的作用[21]。

在蓝芩口服液治疗COVID-19的基因靶点PPI网络中，MAPK8、IL6、CASP3、IL10、MAPK1、CXCL8、CCL2、IL1B、PTGS2、IFNG处于核心地位可能是蓝芩口服液治疗COVID-19的主要作用靶点，其中IL6、IL10、IL1B与炎症反应相关，MAPK8与MAPK1是MAPK家族成员，可在癌症、病毒感染等多种应激条件下被激活，从而产生逐级磷酸化，在炎症反应、细胞增殖分化、细胞凋亡等多个方面发挥作用[22]。CCL2、CXCL8均属于趋化因子家族成员，同时CCL2与CXCL8又都属于炎性趋化因子，在炎症反应中有着重要作用[23]。CCL2在免疫调节中起到调控巨噬细胞的吞噬作用及调控T淋巴细胞产生抗体的作用[24]。有研究表明，CCL2可通过促进HIV-1病毒的复制进而促进了艾滋病的发展[25]。

通过对蓝芩口服液治疗COVID-19的基因靶点GO和KEGG富集分析，可以观察到，蓝芩口服液治疗COVID-19涉及多个生物学过程和分子信号通路，提示了蓝芩口服液在治疗COVID-19中有着多靶点调控，多方面作用的特点。其中KEGG富集分析结果显示，蓝芩口服液主要活性成分作用基因靶点参与了癌症通路、南美锥虫病、甲型流感通路、肺结核通路、TNF信号通路、乙型肝炎通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路等信号通路，不难发现，上述通路涉及了病毒感染、细菌感染、免疫调控、炎症反应等多个方面。

本研究从网络药理学的角度，筛选与分析了蓝芩口服液治疗COVID-19的相关作用靶点及其相关分子信号通路，说明了蓝芩口服液在治疗COVID-19上有着多靶点调控、多方面作用的特点。在蓝芩口服液中，5味主要中药材均属性寒、性凉一类的药材，如长期或大量服用可伤脾胃，故在治疗COVID-19时应注意辨证论治，同时网络药理学有着一定的局限性，后续应对各药材的主要活性成分及相关靶点、信号通路做进一步实验验证，从而为后期COVID-19药物的开发提供依据。