牛冷冻精液检测技术及质量控制

陈大芳， 李 平， 申金容， 唐明宗， 张云淞， 曾 金

(贵州省种畜禽种质测定中心，贵州 贵阳 550018)

在我国的养牛业生产过程中，采用牛冷冻精液进行人工授精技术已得到广泛推广和应用，其中精液质量的优劣直接影响到遗传改良效果。世界上畜牧业先进发达的国家都已将种畜精液质量安全列入监管范围[1]。近年来，我国为提高畜禽种业发展质量，加强了对牛冷冻精液的常态化市场监管，以便为养牛生产提供更多更好的冻精产品。其质量监控依据《牛冷冻精液》(GB 4143—2008)进行检测，检测指标有冻精外观、剂型剂量、精子活力、前进运动精子数、精子畸形率、细菌数等[2]。本文主要针对牛冷冻精液的检测项目内容及相关质量控制环节进行介绍，供同行参考。

1 检测条件要求

1.1 检测室环境室内保持清洁、整齐、安静、无异味，配备控温(空调)、控湿(除湿机)设备，保证工作时室温在20～25 ℃，相对湿度在35%～55%，有温湿度计监控并进行记录。非相关人员不得进入实验室，工作时应穿戴洁净的工作服、手套、口罩、鞋、帽等，保持洁净无菌的工作环境[3]。进行细菌项目检测的实验室要求安装紫外线杀菌灯，工作进行前与结束后均应打开紫外线灯灭菌。

1.2 仪器设备按标准要求配置检测仪器设备的数量、性能和精度，保持仪器完好率为100%。计量器具按照规定进行检定和校准，仪器设备进行正常维护，填好仪器的运行日志和维护日志，注意精密仪器的防尘。玻璃器皿类用清水浸泡后在加有洗涤剂的温热水中刷洗干净，再依次用洁净水冲洗、消毒、干澡后备用[3]。

1.3 试剂耗材化学试剂要使用分析纯，严禁使用过期试剂。培养基及染色试剂可选择商品化的半成品，无论是一次性或可重复使用的耗材都必须是无菌、无毒，如培养皿、载玻片等[3]。药品柜要上锁并张贴标签。试剂要分类存放，药品容器的密封要求良好。危险化学药品应建立单独保管室及专门的柜体保存。

2 抽样要求

2.1 生产方抽样生产方和使用方为质量保证概率把关，按照《孤立批计数抽样检验程序及抽样表》(GB/T 15239—1994)采用LQ=8.0模式A抽样方案检索1次抽样方案，确定抽样公牛样本量。

2.2 质量监督抽样质量监督抽样检验按照《产品质量监督小总体计数一次抽样检验程序及抽样表》(GB/T 15482—1995)采用D0=10，选用第2检验等级的抽样方案，确定抽检公牛的样本量。

3 检测项目指标

3.1 外观肉眼观察精液颜色、气味是否异常(正常呈乳白色、略带腥味)，有无任何杂质，包装是否完整规范，细管的管壁(或包装袋)上是否标识生产站名、公牛品种、公牛号、生产日期或批次，观察细管外观应为“无裂痕，两端封口严密”。

3.2 剂量取3支细管冻精于37 ℃水浴锅中解冻2 min，擦去细管上的水分，剪去两端，把精液分别倒入一小试管内，用电动移液器准确吸取精液，读取读数并记录读数结果。3支冻精的剂量平均数为该样品剂量的检测结果。计算公式如下：

Q：剂量值(mL)；n1：第1支样品剂量(mL)；n2：第2支样品剂量(mL)；n3：第3支样品剂量(mL)

3.3 精子活力取3支细管冻精放置在37 ℃水浴锅中解冻，将3支解冻的精液混合加入1.5 mL离心管中，取精液50 μL置于精液质量分析系统显微镜专用载玻片上，显微镜载物台温度保持在38 ℃，用200～400倍显微镜观察精子活力。每个样片观察3个视野，并观察不同视野的精子运动状态，进行精子活力判断。计算公式如下：

M：活力；n1：第1视野活力；n2：第2视野活力；n3：第3视野活力

3.4 每剂量前进运动的精子数吸取解冻精液20 μL，注入盛有3.0%氯化钠溶液0.98 mL的试管中，混匀，使之成为50倍稀释精液。将备好的血球计数板用盖玻片将计数室盖好，用移液枪吸取稀释精液打入盖玻片边缘，使精液自行流入到计数室中，均匀充满，不能有气泡或厚度过大，在400倍显微镜下观察计数。(1)每剂量中精子数=5个中方格精子数×250万(细管)×剂量值。(2)每剂量中呈前进运动精子数计算：C=s×m[C：每剂量中前进运动精子数(个)；s：每剂量中精子数(个)；m：活力(%)]。

3.5 精子畸形率

3.5.1 抹片用移液器吸取解冻精液1滴于载玻片一端，用另1张载玻片的一边与样品呈35°夹角，将精液样品均匀涂抹于载玻片上，然后自然风干约5 min，每个样品制备2～3个抹片。

3.5.2 固定在风干的抹片上滴中性福尔马林固定液1.0～2.0 mL，固定15 min后用清水缓缓冲去固定液，然后自然风干或吹干。

3.5.3 染色用移液管移取姬姆萨原液2 mL、磷酸缓冲液3 mL、蒸馏水5 mL于带有平槽的有机玻璃槽中，将固定好的抹片反扣在有机玻璃面上，使姬姆萨染液滴于槽和抹片之间，让其充满平槽并使抹片接触染液，染色1.5 h后用清水缓缓冲去染液，并自然风干待用。

3.5.4 镜检制备好的抹片用显微镜(400～600倍)观察，每个抹片观察200个以上的精子(分左、右2个区)，取2片的平均值，2片的变异系数不得大于20%。观察时应有序、系统地观察每个视野内的正常精子和畸形精子，边观察，边用血球分类计数器进行计数。精子的各种形态描述：(1)正常精子：头颈部为椭圆形，中尾部自然延伸且均匀，头颈、中段和尾部都正常时可计为正常精子。(2)畸形精子：头部畸形有大头、小头、锥形头、梨形头、圆头、无定形头和双头等；颈部和中段畸形有颈部“弯曲”、中段非对称地接在头部、粗的或不规则的中段、异常细的中段或无线粒体鞘等；尾部畸形有短尾、多尾、发卡形尾、尾部断裂、尾部弯曲(>90°角)和尾部宽度不规则等。

3.5.5 精子畸形率计算公式如下：

A：精子畸形率(%)；A1：畸形精子数(个)；S：精子总数(个)

3.6 细菌数(1)培养基的配制(营养琼脂培养基和普通琼脂培养基均可)，营养琼脂培养基质量应符合《食品卫生微生物学检验 菌落总数测定》(GB/T 7489.2—2003)要求。普通琼脂培养基的制作：牛肉浸膏5 g，蛋白胨10 g，磷酸氢二钾1 g，氯化钠5 g，用蒸馏水1 000 mL溶解后加琼脂粉20 g，加热溶解。校正pH值为7.4～7.6，并用脱脂棉过滤，分装于锥形瓶中高压灭菌。(2)将灭菌培养基平皿编号，细管冻精37 ℃水浴解冻，用酒精棉球擦拭以保证无菌操作，将1支全部注入到平皿中，把已凉至50 ℃的普通琼脂培养基(或营养琼脂培养基)以无菌操作倒入平皿内，每皿约15 mL，并平放置平皿进行摇动混匀，使精液和琼脂充分混匀。同时做空白对照平皿。待琼脂凝固后翻转平皿，置于37 ℃恒温培养箱培养48 h取出，计数平皿内菌落数。每头牛取2支做2个平皿，取平均值。计算公式如下：

B：细菌数(个)；n1：第1个平皿菌落数(个)；n2：第2个平皿菌落数(个)

4 检测结果判定

4.1 检验分类分常规检验与型式检验。(1)常规检验是对冻精的单项目进行检验，是型式检验的一部分，主要是在生产批入库前和销出时的检验。(2)型式检验是对冻精全部项目检验，评定产品质量是否全面符合标准，也是在生产方抽样检验、仲裁和质量监督抽样检验时选定项的检验。

4.2 结果判定依据《牛冷冻精液》(GB 4143—2008)的规定要求进行结果判定(见表1)。结果达到指标要求判为“合格”，反之则为“不合格”。对“不合格”的精液产品要立即停止生产、经营和使用。

表1 牛冷冻精液检测项目指标合格判定

4.3 判定示例进行常规检验或型式检验时，样品中全项指标检测达到要求才能判为“合格”，样品中任何1项检测未达到标准要求的规定则判为“不合格”。结果判定示例见表2。

表2 牛冷冻精液产品质量监督检测示例

5 检测质量的控制

实行严格的管理制度，着力提升各个环节的检测质量，加强对管理体系文件的把控，定期开展内审与管理评审，保持检测过程的有效性与合理性，完善检测体系质量手册、程序文件、作业指导书文件内容，制订有效的质量控制方案，以保证检测结果的准确性。

5.1 人员考核在检测分析过程中，人为因素是影响结果的主要因素，检测人员的技术水平与操作技能会在很大程度上影响检测结果[3]。对参与检测的技术人员进行严格培训，认真学习检测标准，理解标准内容并按要求进行检测，确保能熟练掌握实验原理及检测技术要点。实验室要重视对新上岗人员的考核，组织人员检测比对时要以本实验室经验丰富和能力稳定的检测人员结果作为参考值。如：精子畸形率的检测技术难点主要在制片技术和读片技术方面，对正常精子应达成统一正确的认识，能够熟练鉴别正常精子形态与非正常精子形态并准确计数，准确计算畸形率。

5.2 能力验证能力验证通常有人员比对、仪器比对、实验室比对等方法。开展经常性的检验比对、统一检测方法可显著提高检测水平，保证检测结果的可信度。比对样本要有代表性，提供同一样本交各检验员进行精子检测和分析，如果误差在允许范围内则考核合格。也可以开展实验室之间的能力比对，定期将样本送给具有相应检测能力的实验室检测，将结果进行比较、分析是否有差异等[1]。

6 小结

牛冷冻精液质量检测是牛人工授精工作的1项常规检测技术，在养牛业生产过程中被广泛应用。掌握好牛冷冻精液的检测技术，开展好常规检验与型式检验，可为种牛精液质量安全常态化监管提供技术支撑，生产单位才能为社会提供更多更好的种牛产品，为助推畜牧业的可持续发展打下坚实的基础。