小鼠盲肠胚后发育的组织学观察和黏蛋白含量测定

刘晓东， 彭利兰， 莘海亮， 龙征荣

(黔东南民族职业技术学院，贵州 凯里 556000)

盲肠是大肠的起始部，下端为膨大的盲端，左侧与回肠末端相连，上端连接升结肠，以回盲瓣与升结肠及回肠为界。盲肠壁结构分为4层，由外向内依次为：浆膜层、平滑肌层、黏膜下层和黏膜层。平滑肌层的外层为纵行肌纤维，内层为环形肌纤维，二者都以螺旋式走行，以收缩和舒张来完成肠的机械性消化。黏膜层又分为3层：靠近黏膜下层的是1层平滑肌，称为黏膜肌层；中间为结缔组织，又称为固有层；最后面向肠腔的是1层柱状上皮细胞构成的黏膜[1]。杯状细胞是混在黏膜上皮中的黏液分泌细胞，底部狭窄，顶部膨大，充满黏原颗粒，HE(苏木精-伊红)染色为蓝色或空泡状(多为空泡状)。黏原颗粒主要是黏蛋白，黏蛋白分泌后与水结合形成黏液，有润滑和饱和作用。本试验通过对不同日龄小鼠盲肠黏膜厚度、肌层厚度和杯状细胞分泌的黏蛋白测定及组织学观察，探讨小鼠盲肠的生长发育规律，从而为盲肠黏膜结构及功能的研究提供基础参考资料。

1 材料与方法

1.1 主要仪器莱卡石蜡切片机(RM2235)、光学显微镜(OLYMPUSCX23)、光学显微照相仪(Nikon ECLIPSE 50i)、数显恒温箱(HH-6)、电子天平(AE323J)。

1.2 主要试剂酒精、甲苯、石蜡、蛋白胶、二甲苯、中性树脂胶、10%福尔马林、苏木精、伊红、中性福尔马林固定液、1%阿利新兰醋酸水溶液、过碘酸溶液、1 mol/L盐酸、1%氨水、偏重亚硫酸钠、无色品红液(Schiff氏液)、Carnoy(卡诺氏)固定液。

1.3 试验动物及饲料健康怀孕雌性昆明小白鼠24只，购自四川农业大学动物生理实验室。日粮配方含量和营养水平符合实验小鼠的饲养标准(NRC 1994)，其中：玉米51.73%，鱼粉3%，钙1.3%，食盐0.3%，棉粕3%，豆粕28%，磷酸氢钙1.3%，总磷0.57%，油2.5%，预混料1%。

1.4 盲肠黏膜发育情况观察分别随机选取出生后第1、3、5、10、15、20、25、35、50日龄健康昆明小鼠各4只(雌、雄各半)，先禁食24 h，采用脊椎脱位法处死，剖腹取出盲肠，常规石蜡包埋，制作连续横断切片，通过DPS数据处理系统(7.05版)软件图像分析系统观察盲肠黏膜发育情况。

1.5 盲肠黏膜及肌层厚度检测每只小鼠取新鲜盲肠组织3段(1.5 cm/段)，用10%中性福尔马林固定24 h，随机取盲肠1段修整后常规石蜡包埋，制作连续横断切片(4 μm)3片，HE染色，常规光学显微镜下(40×)观察。每只小鼠取5张不连续的切片，每张切片随机取5个视野，每个视野用以上图像分析系统测定4个黏膜的长度和肌层的厚度，并观察小肠黏膜形态发育中的组织学变化。

1.6 阿利新蓝-PAS染色检测黏蛋白取新鲜盲肠组织2段(1 cm/段)编号后，投入Carony固定液固定40 min，用无水酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡、包埋。常规切片厚5 μm，脱蜡，浸入0.5%过碘酸氧化5 min，环境温度20 ℃，用1%阿利新兰醋酸水溶液染色30 min，流水冲洗5 min，再用蒸馏水浸洗2次，Schiff氏液(从冰箱取出升至室温使用)避光染色15 min，0.5%偏重亚硫酸钠浸洗2次，每次1 min，流水冲洗5 min，蒸馏水冲洗，苏木精染色3 min，自来水冲洗，1%盐酸酒精分化，再用自来水充分冲洗，1%氨水返蓝，核染色稍浅为好，流水冲洗，常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜(40×)观察。每个视野用以上图像分析软件测定酸性和中性黏液的平均面积和光密度积分。

1.7 统计学分析黏膜厚、肌层厚、黏液面积和光密度积分数据用“平均数±标准差”表示，用SPSS 20.0软件进行各组数据统计差异显著性分析。

2 结果

2.1 盲肠黏膜发育组织学观察组织学观察结果显示，小鼠黏膜层厚度随日龄增加有增厚的趋势，10日龄和15日龄黏膜厚度较5日龄有增加，35日龄黏膜厚度又较10日龄和15日龄有增加。见图1～图4。

图1 5日龄小鼠盲肠壁HE染色

黏膜层未见明显增厚，杯状细胞稍有增多图2 10日龄小鼠盲肠壁HE染色

黏膜层和肌层增厚，杯状细胞明显增多图3 15日龄小鼠盲肠壁HE染色

黏膜层和肌层增厚，杯状细胞进一步增多图4 35日龄小鼠盲肠壁HE染色注：图中Ⅰ为肌层，Ⅱ为黏膜层，箭头指示为杯状细胞

2.2 肠黏膜和肌层厚度测定小鼠盲肠黏膜厚度随着日龄的增加呈锯齿状曲线增厚，1～20日龄均差异不显著(P>0.05)，25日龄以后黏膜厚度比20日龄前显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)增加。肌层厚度随着日龄的增加呈锯齿状曲线增厚，15日龄前均差异不显著(P>0.05)，15日以后显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)增厚。见表1、图5。

表1 1～50日龄小鼠盲肠黏膜和肌层厚度 μm

图5 1～50日龄小鼠盲肠黏膜和肌层厚度变化曲线

2.3 盲肠黏膜的杯状细胞分泌黏蛋白测定不同发育时期盲肠杯状细胞分泌黏液数量不同。PAS染色可定性分析黏蛋白含量；测定黏液面积和光密度积分可定量分析黏蛋白含量，黏蛋白与前者呈正相关与后者呈负相关。通过对1、10、15、25、35日龄小鼠盲肠内黏液面积和光密度积分测定，结果显示随着日龄的增加，黏液面积增加，光密度积分减少。15日龄以后与10日龄以前相比黏液面积差异极显著(P<0.01)，10日龄之前均差异不显著(P>0.05)；10日龄以后与1日龄相比光密度积分差异极显著(P<0.01)。见表2、图6～图9。

表2 盲肠黏液面积和光密度积分

图6 5日龄小鼠盲肠PAS染色

黏蛋白数量增多图7 15日龄小鼠盲肠PAS染色

黏蛋白数量明显增多，颜色深染图8 25日龄小鼠盲肠PAS染色

黏蛋白数量和面积明显增多，颜色深染图9 35日龄小鼠盲肠PAS染色注：图中箭头所示为黏蛋白

3 结论

本试验结果表明，随着日龄的增长，小鼠盲肠的黏膜和肌层逐渐增厚，杯状细胞也不断增多，盲肠的排泄功能和肠黏膜屏障功能不断增强。

4 讨论

4.1大肠的黏膜层与小肠的根本区别是表面没有绒毛，表面光滑亮洁呈红白色。在显微镜下观察，大肠黏膜层由单层柱状上皮细胞和许多杯状细胞构成，杯状细胞能分泌黏液保护肠壁润滑粪便。肌层是大肠运动的主要动力来源。小鼠为杂食性动物，与豚鼠、家兔等草食性动物相比肠道较短，盲肠不发达，肠内能合成维生素C。其盲肠壁的各层都明显比其他部分的肠壁薄，淋巴组织也没有肠的其他部分发达[2]。肠黏膜是吸收营养物质的主要器官，营养物质的消化吸收主要在动物肠道进行，肠道健康与否直接影响动物对营养物质的摄取。特别是幼龄动物肠黏膜发育尚不完全，其生长、发育及健康状况会影响动物的生长、抗病、免疫力等诸多方面[3]。本试验结果显示，小鼠盲肠黏膜和肌层厚度在总体趋势上随着日龄的增加呈现锯齿状曲线增加，这可能与肠黏膜处于发育状态有关。

4.2杯状细胞是黏膜层中的黏液分泌细胞，也广泛见于动物的其他器官中，虽然是分散孤立的细胞，但具有显著的分泌机能。其分泌的黏液或前驱物质贮存于细胞中，有核的基底部较细而接近分泌物的贮留部从边缘部分膨大，形状犹如酒杯。脊椎动物肠黏膜中的杯状细胞摄取葡萄糖和氨基酸，形成糖蛋白并贮存于杯状部，随后释放入肠腔中形成黏液[4]。大肠内的黏液主要呈酸性和中性，是推动大便的润滑剂。据报道，肠上皮细胞与杯状细胞分泌的黏液及绒毛内淋巴细胞分泌的抗体共同组成一道免疫防护屏障，是黏膜免疫系统的一部分[5]。由此可见，免疫系统也伴随小鼠的生长发育而逐渐完善。小鼠的盲肠黏液细胞基本上全部由杯状细胞构成，并且随着日龄的增长，其数量也在不断增加，盲肠的发育逐渐成熟，排泄功能逐渐完善。