儿童幽门螺杆菌感染后的胃内菌群结构分析*

汤志鸿，蒋丰智，黎小秀，段高羊，廖 琼

东莞市妇幼保健院儿科,广东 东莞 523000

目前国内外关于儿童胃微生态研究甚少，幽门螺杆菌（HP）是胃内第一个被发现的细菌，全球超过一半的人口感染幽门螺杆菌［1］，中国儿童幽门螺杆菌感染率为12.8%［2］，幽门螺杆菌感染后儿童会出现非特异性症状，如呕吐，恶心，体重减轻，呕血和食欲下降。慢性幽门螺杆菌感染可引起生长发育迟缓、缺铁性贫血、免疫性血小板减少症［3］。幽门螺杆菌菌株、宿主、内环境等多方面因素决定了疾病的发生发展。目前儿童人群中缺乏关于胃细菌群落的存在和组成的研究，本研究对东莞市妇幼保健院门诊及住院部有消化道临床症状而接受胃镜检查的患儿，钳取胃黏膜标本用于快速尿素酶试验、组织病理学检查、DNA提取，分析HP阳性组和HP阴性组两组之间的社会人口资料学、体重指数、尿素呼气试验、病理组织结果等临床特征，通过16SrDNA检测技术分析HP感染后儿童胃黏膜中的微生态菌群的变化，探索幽门螺杆菌感染对胃内菌群结构组成的影响，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集东莞市妇幼保健院儿科门诊及住院部有消化道临床症状来就诊的患儿，不同程度伴有腹痛、腹胀、恶心、呕吐、嗳气及食欲不振等不适症状；年龄＜14周岁，既往未进行过抗HP治疗。完善13 C尿素呼气试验、粪便HP抗原检测，完善胃镜检查、钳取胃黏膜标本用于快速尿素酶试验、组织病理学检查、DNA提取。按幽门螺杆菌感染的诊断标准：符合下述四项之一者可判断为HP现症感染［4］：（1）组织病理学检查和快速尿素酶试验均阳性；（2）尿素呼气试验或粪便HP抗原检测阳性，并且组织病理学检查或快速尿素酶试验结果其中一项阳性；（3）有消化性溃疡出血，病理组织学或尿素呼气试验中任一项阳性。将患者分为HP阴性组14例和HP阳性组26例。

1.2 方法

（1）胃黏膜标本采集，胃镜下分别钳取受试者胃窦黏膜活检样本，大小约1 mm×2 mm。取材后标本置于无菌冻存管中并加入500 uL生理盐水，立即于-80℃保存。（2）基因组DNA提取和16S rDNA扩增测序：将胃黏膜组织连同生理盐水转移至组织研磨器进行组织匀浆，使用试剂盒QIAamp@DNA Mini Kit(QIAGEN，Germany)提取样本总DNA，具体操作步骤见说明书。设计引物，对16S rDNA V3-V4区进行扩增，引物序列为：341F(CCTAYGGGRBGCASCAG)和806R(GGACTACNNGGG

—TATCTAAT)。PCR纯化、纯化PCR产物，纯化产物进行测序反应，应用Illumina HiSeq 2000测序平台，分析测序结果，分析在门、属分类水平统计各样本的群落组成。

1.3 统计学方法

使用SPSSl3.0软件进行统计整理分析，χ2检验比较HP阳性组和HP阴性组体重指数、病理组织结果的差异。Mann-Whitney U检验比较HP阳性组和HP阴性组微生物群落的丰度和多样性差异。统计各样本在门、属分类群的分布情况，并用柱状图进行展示。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HP阳性组和HP阴性组临床特征分析

两组之间的社会人口资料学、体重指数、尿素呼气试验、病理组织结果等临床特征分析。HP阳性组26人，男性14例，女性12例，平均年龄（7.66±1.69）岁。阴性组14人，男性8例，女性6例，平均年龄（7.45±1.63）岁。对两组患者的年龄、性别资料进行比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。HP阳性组体重过低（BMI＜18.5 kg/m2）的患儿比例为69.2%，非体重过低（BMI＞18.5 kg/m2）的患儿比例为30.3%（P=0.04），幽门螺杆菌感染组患儿体重过低，差异有统计学意义。病理组织结果显示，HP阳性组活动性浅表性胃炎、出血性胃炎、胃溃疡的比例高于HP阴性组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 HP阳性组和HP阴性组临床特征分析 例(%)

2.2 多样性分析

通过对测序所得的细菌物种数量的稀释曲线来表示物种丰度和多样性，见图1。HP阴性组的物种丰度和物种多样性高于HP阳性组，差异有统计学意义（P=0.001），表明幽门螺杆菌感染会显著降低胃黏膜细菌群落的多样性。

图1 HP阳性组和HP阴性组的稀释性曲线图

2.3 组间物种差异分析

在门水平，HP阳性组和HP阴性组的优势物种的种类相同，但所占的比例有所不同，图2柱状图展示两组的门水平的物种分布。其中HP阳性组为： Proteobacteria变形菌门（64%）、Firmicutes厚壁菌门（13%）、Bacteroidetes拟杆菌门（8%）、Actinobacteria放线菌门（6%）、Fusobacteria梭杆菌门（5%）。而HP阴性组为Proteobacteria变形菌门（46%）、Firmicutes厚壁菌门（23%）、Bacteroidetes拟杆菌门（13%）、Actinobacteria放线菌门（6%）、Fusobacteria梭杆菌门（2%）。

在属水平上，HP阳性组和HP阴性组两组在属水平的物种分布柱状图（图3），HP阳性组Helicobacter螺杆菌属比例高达62%，螺杆菌属是变形菌门的一种，这也是引起HP阳性组变形菌门比例明显升高的因素。除螺杆菌属外，HP阳性组Prevotella普氏菌属（7%VS 3%）、Fusobacterium梭杆菌属(6%VS 3%)比例较HP阴性组高。

图2 HP阳性组和HP阴性组两组在门水平的物种分布柱状图

图3 HP阳性组和HP阴性组两组在属水平的物种分布柱状图

3 讨论

传统上，胃微生物群落特征的方法主要依赖于胃黏膜或胃液的分离培养，但对苛养菌及生长缓慢的细菌分离培养很棘手，80%的细菌是不可培养的［5］。因此传统的分离培养方法很难全面的认识胃黏膜菌群分布特征。16 SrDNA编码原核生物16S rRNA的基因，存在于所有细菌、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体和放线菌等原核生物的基因组中［6］，由多个保守区和与之相间的多个可变区组成。保守区为所有细菌共有，细菌之间无显著差异；可变区在不同细菌之间存在一定程度的差异，具有细菌种属特异性。PCR扩增16S rDNA V3-V4区，可将标本中的细菌鉴定到门、属乃至菌株水平。16 SrDNA测序技术因此被视为细菌鉴定与分类的金标准，具有通量高、速度快、准确度高的优势［7］。Mera等［8］人的研究报道了幽门螺杆菌的感染对身高和体重有重大影响。Goodman等［9］研究了幽门螺杆菌感染的学龄期儿童，结果显示幽门螺杆菌感染后体重生长速度减慢。在我们的研究中，幽门螺杆菌感染组患儿体重过低（BMI＜18.5 kg/m2），幽门螺杆菌感染后生长受限，可能是幽门螺杆菌感染致慢性胃炎，难治性铁缺乏性贫血的结果，另一种可能的解释可能是胃炎影响了控制食欲的激素。成人幽门螺杆菌感染者胃内菌群特征的研究表明，幽门螺杆菌能显著影响胃内菌群结构［10］，儿童幽门螺杆菌感染也会影响胃内菌群状态［11］。本研究结果证实，儿童幽门螺杆菌感染后胃黏膜细菌群落数量显著下降，物种相对丰度下降。幽门螺杆菌感染也影响胃内菌群的结构差异，幽门螺杆菌感染患儿Prevotella普氏菌属、Fusobacterium梭杆菌属相对丰度升高，炎症反应程度会加剧。本研究发现幽门螺杆菌感染后Prevotella普氏菌属、Fusobacterium梭杆菌属相对丰度增高，病理组织结果显示HP阳性组活动性浅表性胃炎、出血性胃炎、胃溃疡的比例增高，幽门螺杆菌可能与这些细菌相互作用，共同导致胃内一系列疾病的发生发展。

综上所述，幽门螺杆菌感染影响儿童体重、胃内病理组织、胃内菌群结构，幽门螺杆菌可能与胃内菌群共同促进胃部疾病的发生、发展。从胃微生态的角度，重建胃内微生态环境，对幽门螺杆菌感染相关疾病的治疗有良好的临床意义和应用前景。