中国成年吸烟者吸烟行为调查和烟气有害成分暴露评估

赵俊伟，赵阁，华辰凤，尚平平，李翔，王昇，张晓曦，谢复炜*，栾荣生，刘惠民

1.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号450001

2.四川大学华西公共卫生学院，成都市人民南路三段16号610041

吸烟有害健康。虽然基于吸烟机测试的卷烟烟气释放量的结果提示，低焦油卷烟可能会降低吸烟者的有害物质暴露［1］，然而由于吸烟机抽吸方式与吸烟者实际吸烟行为存在一定差异，因此该结果并不被卫生部门所认可［2］。暴露生物标志物（Biomarkers of exposure，BoE）可反映吸烟者有害物质实际暴露量，已被用于烟草制品风险评估［3-6］，并被用于研究低焦油卷烟是否能够降低烟气有害成分暴露量。用于评估的有害成分主要包括烟碱、烟草特有亚硝胺（TSNAs）、多环芳烃（PAHs）、挥发性有机物、挥发性羰基物、丙烯酰胺和氰化氢（HCN）等［6-9］。Mendes等［6］的研究结果表明，烟碱、TSNAs、芘、丙烯醛、1,3-丁二烯等有害成分的暴露生物标志物，在低焦油组人群尿液中的质量分数较低。Shepperd等［10］的研究结果显示，吸烟者转抽低焦油卷烟，丙烯醛暴露量显著降低。Hagedorn等［11］研究发现，与抽吸4或10 mg/支盒标焦油量的卷烟相比，抽吸1 mg/支的吸烟者尿液中的多个PAHs生物标志物，例如，1-羟基萘、2-羟基萘、1-羟基芘和2-羟基芴的质量分数显著降低。这些研究结果表明，吸烟者抽吸低焦油卷烟，能够降低有害成分暴露量。然而，Hecht等［7］的研究表明，卷烟焦油量与生物标志物暴露量之间没有明显相关性。还有其他研究表明，吸烟者抽吸低焦油卷烟时，除增加每口的抽吸深度外，还会通过增加抽吸口数和频度来进行完全或部分补偿吸烟［12-13］。Scherer等［5］的研究显示，卷烟焦油量对吸烟者实际吸烟量的影响很小，甚至没有影响。Benowitz等［14］的研究表明，所谓的“淡味”卷烟不可能降低吸烟者的健康风险。这些研究结论存在矛盾，可能是由于不同研究中生物标志物分析方法、涉及的卷烟设计、选择的吸烟者群体以及不同人群文化和生活方式等因素存在差异造成的。

目前，中国吸烟者大规模吸烟行为和生物标志物的人群研究鲜有报道。其中，GAN等［15］的研究中，招募了543名抽吸不同焦油量卷烟的吸烟者，考察了烟碱和一些致癌物的暴露量，研究结果发现，吸烟者尿液中可替宁、反-3′-羟基可替宁和多环芳烃暴露量与卷烟焦油量没有相关性。然而，该研究检测的生物标志物数量有限，且仅分析了部分人群样本，同时也没有考虑人口学特征和吸烟行为等因素的影响。因此，采用吸烟行为问卷调查和30多种暴露生物标志物（烟碱、TSNAs、PAHs、挥发性有机物、挥发性醛类等）研究了435名中国成年吸烟者的吸烟行为和生物标志物暴露量，旨在客观评价不同焦油量吸烟者的吸烟行为及其影响因素，为低焦油卷烟的风险评估提供数据支撑。

1 材料和方法

1.1 材料、试剂和仪器

烟碱（NIC）、可替宁（COT）、可替宁糖苷（COT-G）、降烟碱（NNIC）、降可替宁（NCOT）、烟碱氮氧化物（NNO）、可替宁氮氧化物（CNO）、反-3′-羟基可替宁（OHCOT）、反-3′-羟基可替宁糖苷（OHCOT-G）、NIC-d3、COT-d3、OHCOT-d3、NIC-G-d3、COT-G-d3、OHCOT-G-d3、NNIC-d3、NCOT-d3、CNO-d3、NNO-d3、NNN、NAB、NAT、NNAL、NNN-d4、NAB-d4、NAT-d4、NNAL-d3、1-羟基萘（1-OHNap）、2-羟基萘（2-OHNap）、1-羟基芘（1-OHPyr）、3-羟基芴（3-OHFlu）、1-羟基菲（1-OHPhe）、2-羟基菲（2-OHPhe）、3-羟基菲（3-OHPhe）、4-羟基菲（4-OHPhe）、9-羟基菲（9-OHPhe）、2-羟基芴（2-OHFlu）、1-OHPyr-d9、3-OHPhe-d9、2-OHFlu-d9、1-OHNap-d8、2-氨基噻唑啉-4-羧酸（ATCA）、13C-14N2-ATCA、苯巯基尿酸（SPMA）、SPMA-d5、丁烯二醇巯基尿酸（DHBMA）、丁烯醇巯基尿酸（MHMBA）、DHBMA-d7、MHBMA-d6、3-羟基丙基巯基尿酸（3-HPMA）、3-HPMA-d3、3-羟基甲基丙基巯基尿酸（3-HMPMA）、3-HMPMA-d3、N-乙酰基-S-（2-羧乙基）半胱氨酸（CEMA）、CEMA-d3、N-乙酰基-S-（2-羟乙基）半胱氨酸（HEMA）、HEMA-d3、N-乙酰基-S-（2-氨基甲酰基）半胱氨酸（AAMA）、AAMA-d4、N-乙酰基-S-（2-氨基甲酰基-2-羟乙基）半胱氨酸（GAMA）、GAMA-d3等标样均购自加拿大TRC试剂公司；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Baker公司）；β-葡糖苷酸/芳基硫酸酯酶（美国Sigma公司）；甲酸、甲酸铵、醋酸铵（色谱纯，美国Tedia公司）。

API4000高效液相色谱-质谱联用仪（HPLC-MS/MS，美国应用生物系统公司）；CP2245分析天平（感量0.000 1 g，德国Sartorius公司）；Milli-Q50超纯水仪（美国Millipore公司）；N-EVAPTM 112氮吹仪（美国Organomation公司）；THS-10精密型超级恒温槽（宁波天恒仪器厂）；Zorbax Hilic plus色谱柱（100 mm×2.1 mm i.d.,3.5 μm，美国Agilent公司）。

1.2 方法

1.2.1 研究设计

本研究中采用横断面研究方法［6］。在四川成都招募435名志愿者，根据志愿者实际抽吸卷烟的盒标焦油量进行分组，其中高焦油组（焦油量9～11 mg/支）207名，中焦油组（焦油量7～8 mg/支）70名，低焦油组（焦油量1～6 mg/支）51名及非吸烟组107名。采用调查问卷的方式，调查志愿者的人口学特征、吸烟行为和烟碱依赖等信息，并收集其24 h内的尿液。整个研究过程中采用多种措施进行质量控制，包括征求专家意见设计调查问卷；对调查人员进行集中培训以确保调查方式的一致性；调查数据由训练有素的人员进行双重数据录入，即同一份问卷由两名人员录入，在数据库中比对录入的数据结果，若一致则直接录入数据库，不一致则转至质检人员进行核对后再导入数据库，避免1人录入问卷数据可能存在的错误，确保数据录入质量。本研究通过了四川大学华西公共卫生学院医学伦理委员会的批准，志愿者均签署了知情同意书。

1.2.2 研究对象

招募符合纳入标准的志愿者。纳入标准（需同时满足）：①年龄18～65周岁；②过去6个月每日吸烟量至少5支；③无心血管、呼吸或神经系统疾病史；④过去一年内未接受过任何精神疾病治疗；⑤近一周内未服用任何药物；⑥能遵守研究规定，并提供尿液样本。

1.2.3 问卷调查

问卷调查获取志愿者的基线资料［7］和吸烟行为数据。问卷内容包括：①人口学特征，包括年龄、性别、身高、体质量、职业、收入和文化程度等；②烟碱依赖Fagerström量表（FTND）［16］，用于评价烟碱依赖程度；③吸烟行为数据，包括吸烟支数、吸入深度、抽吸间隔等。

1.2.4 生物标志物分析

表1为32种有代表性的有害成分暴露生物标志物信息。采用尿肌酐校正测试结果。使用氘代内标，所有生物标记物均通过HPLC-MS/MS和API 4000或5500质谱检测器进行多反应监测（MRM）模式分析。烟碱、TSNAs为正离子检测模式；PAHs、挥发性羰基物、挥发性有机物、HCN和丙烯酰胺为负离子检测模式。生物标志物分析方法如下。

表1 烟气有害成分生物标志物Tab.1 Biomarkers of toxicants in cigarette smoke

总烟碱代谢物（NE）：使用实验室前期开发的方法［17］测定烟碱及其9种主要代谢物。以所有代谢物的摩尔浓度总和［以烟碱总代谢物（NEq）表示］为烟碱总暴露量。

TSNAs的生物标志物：根据Kavvadias等［18］的方法，采用ESI-HPLC-MS/MS法测定。样品用β-葡萄糖醛酸苷酶酶解，然后通过MIP-TSNAs SPE方法进行净化［18］。4种分析物的定量限（LOQ）范围为2.0～5.0 pg/mL。

PAHs的生物标志物：羟基化的PAHs被用作其生物标志物，本研究中采用Chetiyanukornkul等［19］报道的SPE-HPLC-MS/MS方法进行测定。用β-葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶将样品酶解，并用硅藻土柱净化。10种检测指标的LOQ范围为2～22 pg/mL。

巯基尿酸类化合物：挥发性有机物、丙烯醛、巴豆醛、丙烯酰胺和HCN的生物标志物直接稀释后，采用HPLC-MS/MS法同时进行分析。检测指标 包 括3-HPMA、3-HMPMA、SPMA、CEMA、HEMA、DHBMA、MHMBA、AAMA、GAMA和ATCA。以上检测指标的LOQ范围为0.2～2.1 ng/mL。

1.2.5 指标定义

吸烟者：持续抽吸卷烟6个月及以上，且每日吸烟量5支及以上的吸烟者。卷烟焦油量是指烟盒标注的焦油量（吸烟机在ISO抽吸模式下的焦油量）。高烟碱依赖性是指Fagerström烟碱依赖性（FTND）评分≥5。体质指数（Body mass index，BMI）等于体质量（kg）除以身高的平方（m2）。偏瘦：BMI＜18.5 kg/m2；正 常：23.9 kg/m2≥BMI≥18.5 kg/m2；偏胖：27.9 kg/m2≥BMI≥24.0 kg/m2；肥胖：BMI≥28.0 kg/m2。

1.2.6 统计分析

采用EpiData17.0软件建立数据库，采用SPSS 21.0软件进行统计分析。采用描述性统计方法对志愿者的基线资料进行分析，采用χ2检验分析性别、教育程度、职业、婚姻状况等定性资料的组间差异，采用t检验、单因素方差分析（One-way analysis of variance）对年龄、吸烟量、BMI等定量资料进行组间差异分析，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）对高、中、低焦油组以及非吸烟组的生物标志物数据进行差异分析，采用Dunnett-t检验进行组间两两比较。对于数据不服从正态分布的吸烟者组和非吸烟者组的生物标志物的差异性分析，采用非参数Wilcoxon秩和检验方法。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基本信息

志愿者的基本信息见表2。共调查435名志愿者，平均年龄42.1岁，以男性为主（94.9%，413/435）。受教育程度以初中及以下为主（38.9%，169/435），其次为大专/本科（29.4 %，128/435）。婚姻状况以已婚为主，占82.8%（360/435）。月收入以高于或等于4 000元/月为主（30.8%，134/435），其次为月收入2 000～2 999元 者（27.1%，118/435）。志愿者的年龄、性别、教育程度、职业和收入在不同焦油组间存在显著差异（P＜0.05），而婚姻状况和BMI均无显著性差异（P＞0.05）。

表2 志愿者基本信息①Tab.2 Characteristics of the subjects

2.2 吸烟者吸烟行为分析

不同焦油量吸烟者的吸烟行为数据见表3。不同焦油量吸烟者间的平均吸烟支数无显著性差异（P＞0.05）。不同焦油量吸烟者中，5名吸烟者未应答抽吸间隔，2名未应答吸入深度和剩余烟蒂长度。抽吸间隔以10～19 s为主（37.5%，121/323）；吸入深度以肺部为主（60.1%，196/326），其次为喉部（27.6%，196/326）；剩余烟蒂长度以5～9 mm为主（38.3%，125/326），其 次 为＜5 mm（38.0%，124/326）。志愿者的平均吸烟支数、抽吸间隔、吸入深度、剩余烟蒂长度和烟碱依赖程度在不同焦油组间均无显著性差异（P＞0.05）。

表3 不同焦油量吸烟者的吸烟行为①Tab.3 Self-reported smoking habit of smokers smoking cigarettes with different tar yields

2.3 吸烟者和非吸烟者尿样中生物标志物比较

吸烟者和非吸烟者尿样中暴露生物标志物比较结果见表4。大部分吸烟者尿样中的生物标志物浓度高于非吸烟者（P＜0.05）。32种生物标志物比值（比值=吸烟者尿样中生物标志物的平均值/非吸烟者尿样中生物标志物的平均值）中，降序排列后的前5位是NIC（117.7）、NNO（55.8）、OHCOT（54.8）、NCOT（53.3）和烟碱总代谢产物（52.0）。吸烟者与非吸烟者间的MHBMA、3-OHPhe和ATCA无显著性差异（P＞0.05）。

2.4 不同焦油量吸烟者尿样中生物标志物差异分析

不同焦油量吸烟者尿样中暴露生物标志物直方图见图1。其中，中焦油组与高焦油组相比，少数生物标志物，例如，NIC-G及NNAL的总量显著低于高焦油组，其他生物标志物与高焦油组没有显著差异。

低焦油组与高焦油组相比，尿样中的烟碱生物标志物［总烟碱代谢物（P=0.009）、NIC（P=0.017）、COT-G（P=0.049）、OHCOT（P=0.028）、NNIC（P=0.002）］显著降低；对于多环芳烃类化合物，2-OHNap（P=0.008）显著低于高焦油组。其他化合物，例如，1-OHPyr（P=0.657）、3-OHPhe（P=0.605）等则无显著性差异。对于羰基化合物，HMPMA（P＜0.001）、HPMA（P=0.001）显著低于高焦油组。对于挥发性有机物，低焦油吸烟者尿液中HEMA（P=0.003）、DHBMA（P=0.005）显著低于高焦油组。低焦油组的一些生物指标甚至与非吸烟者组之间没有显著差异，例如，HEMA（P=0.133）和DHBMA（P=0.557）。

低焦油组与非吸烟者组相比，大部分生物标志物显著高于非吸烟者组（P＜0.05）。然而，AAMA（P=0.087）、GAMA（P=0.517）和ATCA（P=0.176）两组之间无显著差异。

3 讨论

本研究中开展了不同焦油量中国吸烟人群的吸烟行为和有害成分暴露评估，是迄今为止较为全面、系统的横断面研究。对调查人群完成了包括人口统计学和吸烟行为的问卷调查。生物标志物暴露评估涉及的卷烟烟气有害成分包括烟碱、TSNAs、PAHs、挥发性羰基物、丙烯酰胺、挥发性有机物和HCN。

表4 吸烟者和非吸烟者尿样中暴露生物标志物比较Tab.4 Comparison of exposure biomarkers in urine from smokers and nonsmokers

人口信息统计分析表明，不同焦油量卷烟的使用情况与吸烟者的年龄、性别、受教育程度、职业、收入、饮酒量之间可能存在相关性，这与文献［12,20-21］中的研究结果一致。受教育程度较低人群可能大多数从事非技术性工作，并可能存在大量或过量饮酒情况，这些群体倾向于选择焦油量较高的卷烟。而受教育程度相对较高的年轻吸烟者和有戒烟史的人群倾向于选择焦油量较低的卷烟。

人群吸烟行为研究结果显示，抽吸不同焦油量卷烟的吸烟者的吸烟支数、抽吸间隔、烟蒂长度和烟碱依赖性之间无显著性差异。这一结论与Dixon等［22］的结果一致，卷烟焦油量不会影响吸烟者的抽吸行为。但也有研究表明，吸烟者在消费较低焦油量的卷烟时，会部分或完全出现补偿行为［9,12,23-24］。研究结果存在差异的原因可能有两个：一是由于不同人种的烟碱代谢不同，中国吸烟者的吸烟行为可能与西方国家存在差异［25］；二是本次研究是基于问卷调查，与实际测试获得的结果可能存在差异［26-27］。本研究结果表明，不同的焦油量并不会显著影响吸烟者的吸烟行为。

图1 不同焦油量吸烟者尿样中烟碱、TSNAs、PAHs、挥发性羰基化合物、挥发性有机物和AM的生物标志物直方图Fig.1 Box plots of biomarkers of nicotine,TSNAs,PAHs,volatile carbonyl compounds,VOCs,and AM in the urine of smokers

吸烟者组和非吸烟者组尿样中的生物标志物测试结果显示，MHBMA、3-OHPhe或ATCA在统计学上无显著差异。PAHs、HCN和挥发性有机物在环境中广泛分布，可能通过职业暴露、吸烟和饮食进入体内［28］，导致非吸烟者组尿样中也可检测到这些生物标志物，吸烟可能不是这些有害成分的主要来源，因此吸烟者组和非吸烟者组尿样中这些有害成分的生物标志物不存在显著性差异。吸烟者组尿样中的生物标志物包括NIC、NNO、OHCOT和NCOT等，烟碱总代谢物、NNAL的平均总量水平是非吸烟者组的10倍以上，表明吸烟是烟碱和TSNAs暴露的主要原因［3,5,10,29-31］。TSNAs为烟草特有成分，非吸烟者尿液中部分检测到的TSNAs可能是通过被动吸烟暴露造成的，部分研究也有相关报道［6,29］。

不同焦油量吸烟者的尿样生物标志物分析结果显示，与高焦油组比较，中焦油组吸烟者尿样中的总NNAL和NAT显著低于高焦油量组，研究结果与之前的报道一致［5,29］，其他化合物则无显著性差异；低焦油组吸烟者的多种生物标志物显著降低。烟碱总代谢物、NIC、NNIC、OHCOT、COT-G和NIC-G显著低于高焦油组，与文献［6］的报道一致；对于TSNAs生物标志物，尽管低焦油组平均值较低，但与高焦油组无明显差异。对于PAHs生物标志物，低焦油组尿液中2-OHNap的浓度明显低于高焦油组，与之前的研究一致［11］。1-OHNap则无显著差异。1-OHNap［5,32］和2-OHNap［11,33］常用作芘暴露的生物标志物，两种化合物显著性差异结果可能是由敏感度差异引起的，2-OHNap比1-OHNap更敏感；HPMA和HMPMA是丙烯醛和巴豆醛的代谢产物［33］。本研究结果表明，低焦油组尿样中HPMA、HMPMA和CEMA均显著低于高焦油组；对于挥发性有机物，低焦油组的DHBMA和HEMA水 平显著降 低，而MHBMA的水平无显著差异。DHBMA和MHBMA均为1,3-丁二烯暴露生物标志物。在本研究中，与MHBMA相比，DHBMA作为1,3-丁二烯暴露生物标志物可能更为敏感；对于丙烯酰胺，低焦油组的GAMA水平也显著降低，AAMA无显著性差异。总体上，与高焦油组相比，低焦油组1,3-丁二烯、环氧乙烷、丙烯腈和丙烯酰胺暴露显著降低。

低焦油组的2-OHNap、1-OHPyr、3-OHPhe、MHBMA、HEMA、DHBMA、AAMA、GAMA和ATCA与非吸烟者组相当，这是由于环境中同样存在多环芳烃、挥发性成分、丙烯酰胺和HCN，低焦油卷烟暴露与非吸烟者环境暴露相当［8］。低焦油组其他大多数生物标志物高于非吸烟组。

与干预研究相比，本研究中采用横断面研究方法，通过问卷调查获取相关信息，获得的吸烟者抽吸高焦油卷烟或低焦油卷烟的论证强度较弱，获得的吸烟行为信息未考虑潜在的回忆偏倚，且未使用仪器准确测试。因此，将来会结合自我报告和实际吸烟行为测试，获得准确的抽吸参数；通过检测抽吸后的滤嘴评估焦油和烟碱的释放量，以获得实际测量数据。抽吸低焦油卷烟的吸烟者体内有害成分暴露量低，是否会影响机体生物效应尚不明晰，需要进一步开展效应生物标志物与有害成分暴露的相关性研究。

4 结论

中国不同焦油量吸烟人群吸烟行为和有害成分暴露评估研究结果表明：①卷烟抽吸者的吸烟行为受年龄、性别、文化程度、职业及收入等因素影响。②卷烟焦油量不是影响吸烟者抽吸支数、抽吸间隔、吸入深度和滤嘴保留长度等吸烟行为的主要因素。③抽吸低焦油卷烟吸烟者尿液中部分有害成分（烟碱、TSNAs、1,3-丁二烯、苯、丙烯醛、巴豆醛等）暴露量较低。