万寿菊秸秆熏蒸对烟株根际土壤原核微生物群落的影响

黎妍妍，李锡宏*，王林，冯吉，张英，尹忠春

1.湖北省烟草科学研究院，武汉市硚口区宝丰路6号香溢大酒店4楼430030

2.湖北中烟工业有限责任公司，武汉市东西湖区金山大道1355号430040

3.湖北省烟草公司恩施州公司，湖北省恩施市施州大道119号445000

烟草是我国重要的经济作物之一，目前连作是我国烟草生产中的主要种植制度。烟草连作障碍在我国烟叶种植区普遍存在，且与根际土壤微生物区系的恶化密切相关。长期连作可降低土壤微生物活性，改变土壤微生物多样性，引起土壤中微生物选择性富集，导致土壤微生物群落结构发生改变［1-2］，造成植物-土壤-微生物形成的相互依赖的生态系统失衡；而根际微生态失衡又会进一步引起土壤环境恶化和病原菌的大量繁殖，使连作障碍加剧。近年来，通过生物熏蒸来缓解连作障碍已成为研究热点之一。芸薹属植物、绿肥等常被用作生物熏蒸材料［3-4］。Lazzeri等［5］、Seigies等［6］和赵卫松等［7］将芸薹属植物残体加入土壤中，发现土壤微生物群落得到明显改善，有益微生物的相对丰度增加；沈桂花［8］研究表明，采用黑麦草、油菜和紫云英等进行生物熏蒸可提高植烟土壤微生物代谢活性；刘昕昕［9］将高硫芥菜用于熏蒸设施连作黄瓜土壤，发现细菌群落多样性显著提高。因此，生物熏蒸通过改善根际土壤微生物区系，可有效克服连作障碍。

在菊科作物中，万寿菊（Tagetes erecta L.）是一种多用途的作物，具有抗菌性能［10］。烟草生产中，Li等［11］发现烟草与万寿菊间作具有改善土壤微生物群落的作用，土壤细菌群落的多样性和丰富度提高，有益微生物的相对丰度增加，而土壤青枯菌的相对丰度则降低。目前，万寿菊秸秆也被用作生物熏蒸材料。王晓芳等［12-14］研究表明，采用万寿菊植物粉末或秸秆熏蒸苹果园土壤，土壤中细菌数量增加、真菌数量减少，真菌群落多样性、均匀度和丰富度指数均降低，可有效缓解苹果连作障碍。然而，关于万寿菊秸秆熏蒸应用于植烟土壤的研究则鲜见报道，对烟株根际土壤微生物群落的影响也不明确。为此，在烟田中设置施用万寿菊秸秆粉末、评价万寿菊秸秆熏蒸对植烟土壤原核微生物群落多样性和结构的影响试验，旨在为缓解烟草连作障碍提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

熏蒸用万寿菊来自上年在烟田周围播撒的试验材料，采集根茎，自然风干后，用粉碎机粉碎，过2 mm孔径筛，备用。

1.2 试验地点与概况

2017—2019年，试验设置在湖北省恩施州宣恩县椒园镇凉风村。试验地烟草连作15年，种植烟草品种为云烟87。

1.3 试验设计与指标测定

1.3.1 土壤主要原核微生物数量分析

1.3.1.1 试验设计

2017年进行万寿菊秸秆熏蒸用量筛选试验。设置5个处理，CK1：不进行万寿菊秸秆熏蒸；T1、T2、T3和T4均为万寿菊秸秆熏蒸处理，用量分别为750、1 500、2 250和3 000 kg/hm2，于烟田施肥后（4月5日）撒施于各试验小区，之后起垄覆膜。每处理3次重复，随机区组排列，每小区共植烟64株。种植行株距为1.2 m×0.55 m，4月25日移栽。其他按当地优质烟叶生产技术规范进行栽培管理。

1.3.1.2 根际土壤样品的取样

2017年于烟苗移栽后50 d和100 d时，在T1、T2、T3、T4和CK1处理每小区中5个区域分别选择1株烟株，按文献［15］的方法采集根际土壤样品，混合形成1个土样，共计30个土样，用于土壤细菌和放线菌的培养。

1.3.1.3 土壤细菌和放线菌数量的测定

采用平板计数法统计T1、T2、T3、T4和CK1处理每克土中所含细菌和放线菌的个数［16］。细菌和放线菌分别采用牛肉膏蛋白胨培养基和高氏1号培养基培养。

1.3.2 土壤原核微生物群落结构分析

1.3.2.1 试验设计

基于2017年研究结果，选取最佳处理，于2018—2019年连续两年（田间试验设置相同）开展试验。设置2个处理，3次重复，共6个小区。CK2：不进行万寿菊秸秆熏蒸；TE：万寿菊秸秆（1 500 kg/hm2）熏蒸，于烟田施肥后（4月5日）撒施于各试验小区，之后起垄覆膜。种植行株距为1.2 m×0.55 m，每小区种植烤烟100株，4月28日移栽。其他按当地优质烟叶生产技术规范进行栽培管理。

1.3.2.2 根际土壤样品的取样

2019年于烟苗移栽后50 d和100 d时，在TE和CK2处理每小区中5个区域分别选择生长基本一致的1株烟株并采集其根际土壤样品，混合后形成1个土样。按照取样时期分别记作TE-50、CK2-50、TE-100和CK2-100，共计12个土样，采集后的土样保存于-80℃冰箱，用于土壤16S扩增子的测序。

1.3.2.3 土壤原核微生物群落分析

（1）DNA提取及PCR扩增。用FastDNA Spin Kit试剂盒（美国MP Biomedicals公司）提取TE和CK2处理土壤总DNA。以样品DNA为模板，用引物515F和806R［515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCG GTAA-3′；806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAA T-3′］对16S rDNA V4可变区进行PCR扩增。PCR扩增体系和反应程序参照文献［15］的方法进行。PCR产物检测合格后进行文库构建，在Illumina Hiseq PE250测序平台上由诺禾致源生物信息科技有限公司进行测序。

（2）操作分类单元（Operational Taxonomic Units，OTU）聚类与物种注释。对所有样品的Effective Tags进行聚类，将相似度≥97%的有效序列归为1个OTU。利用QIIME软件计算土壤微生物群落的多样性指数（Shannon多样性指数和Sobs、Chao1丰富度指数）。对每个OTU的代表序列进行物种注释，并用Mothur方法与SILVA的SSUrRNA数据库进行物种注释分析，获得每个OUT的分类水平。

1.4 数据处理

采用单因素方差分析法（One-way ANOVA）分析土壤主要原核微生物数量在不同处理间的差异（P＜0.05），采用T检验（T-test）分析土壤原核微生物群落多样性指数、物种相对丰度等在TE和CK2处理间的差异（P＜0.05）。根据样品在属水平上的物种注释及丰度信息，根据文献［15］的方法对TE和CK2的前35位菌属的相对丰度进行标准化处理，然后采用HemI软件对标准化值绘制Heatmap图。

2 结果与分析

2.1 土壤细菌和放线菌数量分析

烟株根际土壤中细菌和放线菌数量测定结果见表1。表1显示，细菌和放线菌数量在各处理间存在显著差异。烟苗移栽后50 d时，万寿菊秸秆熏蒸的处理土壤中细菌数量较CK1增加9.80%～98.04%，其中T2、T3和T4处理显著高于CK1；放线菌数量较CK1增加5.11%～53.98%，其中T1和T2处理显著高于CK1。烟苗移栽100 d时，万寿菊秸秆熏蒸的处理土壤中细菌数量较CK1增加10.94%～94.27%，T1、T2、T3和T4处理均显著高于CK1；放线菌数量较CK1增加2.06%～32.99%，其中T2、T3和T4处理显著高于CK1。表明万寿菊秸秆熏蒸能增加土壤中细菌和放线菌数量，但添加量750 kg/hm2（T1）、2 250 kg/hm2（T3）和3 000 kg/hm2（T4）的效果稍劣于1 500 kg/hm2（T3）的处理。因此，本试验中进一步分析了万寿菊秸秆添加量1 500 kg/hm2的熏蒸效果。

表1 土壤细菌和放线菌数量的比较①Tab.1 Amount of bacteria and actinomycetes in soil

2.2 根际土壤原核微生物群落多样性分析

对万寿菊秸秆熏蒸（1 500 kg/hm2，TE）和不熏蒸（CK2）的土壤原核微生物群落（图1）比较发现，烟苗移栽后50 d时，TE-50和CK2-50样品分别得到5 648个和5 233个OTUs，其中两者间共有的OTUs数量为4 141个；烟苗移栽后100 d时，TE-100和CK2-100样品分别得到5 626个和5 520个OTUs，其中两者间共有的OTUs数量为4 330个。表明万寿菊秸秆熏蒸（TE）后土壤原核微生物群落OTUs数量明显增多。

由表2可以看出，烟苗移栽后50 d时，TE-50土壤Sobs、Shannon和Chao 1指数均显著高于CK2-50，较CK2-50分别增加11.81%、6.09%和11.27%。烟苗移栽后100 d时，TE-100土壤Sobs、Shannon和Chao 1指 数 较CK2-100分 别 增 加3.18%、0.21%和3.28%。表明万寿菊秸秆熏蒸可提高土壤原核微生物群落的多样性和丰富度。

图1 各组样本OTUs分布Venn图Fig.1 Venn diagram of OTUs distribution for each soil sample

表2 土壤原核微生物群落多样性和丰富度分析①Tab.2 Diversity and richness indexes of prokaryotic microbial community in soil

2.3 土壤原核微生物群落结构分析

2.3.1 土壤原核微生物在门水平上的组成

在门水平上，对相对丰度排名前10位的土壤原核微生物进行了分析，结果见表3。不同时期检测出TE和CK2土壤样品中优势菌门的相对丰度从高到低依次为变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、厚壁菌门（Firmicutes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、浮霉菌门（Planctomycetes）和硝化螺旋菌门（Nitrospirae）。烟苗移栽50 d时，TE-50土壤中芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）的相对丰度显著高于CK2，其他9个菌门在两处理间差异不显著。烟苗移栽后100 d时，TE-100土壤中变形菌门（Proteobacteria）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）的相对丰度均显著高于CK2，其他8个菌门在两处理间差异不显著。

表3 门水平上土壤原核微生物的相对丰度分析Tab.3 Relative abundances of main soil prokaryotic microbes at phylum level （%）

2.3.2 土壤原核微生物在属水平上的组成

在属水平上，土壤中相对丰度＞1%的土壤原核微生物分析结果见表4。表4表明，烟苗移栽后50 d时，TE-50和CK2-50土壤中分别有8个和5个菌属的相对丰度高于1%；TE-50中水恒杆菌属（Mizugakiibacter）、罗思河小杆菌属（Rhodanobacter）的相对丰度显著低于CK2-50，而鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、未确定属的芽单胞菌科（unidentified Gemmatimonadaceae）［17］和H16的相对丰度显著高于CK2-50。烟苗移栽后100 d时，TE-100和CK2-100处理土壤中分别有11个和6个菌属的相对丰度高于1%；TE-100处理中水恒杆菌属（Mizugakiibacter）、未确定属的芽单胞菌科（unidentified Gemmatimonadaceae）、伯克霍尔德菌属（Burkholderia-Paraburkholderia）和Candidatus Solibacter的相对丰度显著高于CK2-100，而Candidatus Nitrosotalea的相对丰度显著低于CK2-100。

对35个菌属相对丰度的相似性进行HEMI聚类分析，结果见图3。图3表明，烟苗移栽后50 d时，TE-50中鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、假单胞菌属（Pseudomonas）、苯基杆菌属（Phenylobacterium）、变杆菌属（Variibacter）、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、假双头斧形菌属（Pseudolabrys）、未确定属的芽单胞菌科（unidentified Gemmatimonadaceae）、未确定属

的硝化螺旋菌科（unidentified Nitrospiraceae）［18］、Ramlibacter、赭黄嗜盐囊菌属（Haliangium）、溶杆菌属（Lysobacter）、H16和Gaiella的相对丰度较高；CK2-50中水恒杆菌属（Mizugakiibacter）、罗思河小杆菌属（Rhodanobacter）、链霉菌属（Streptomyces）、堆囊菌属（Sorangium）、戴氏菌属（Dyella）、不动杆菌属（Acidibacter）、未确定属的酸杆菌科［unidentified Acidobacteriaceae（Subgroup 1）］［19］、Granulicella和慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）的相对丰度较高。烟苗移栽100 d时，TE-100中RB41、根微菌属（Rhizomicrobium）、Bryobacter、Candidatus Solibacter、Reyranella、伯霍尔德杆菌属（Burkholderia-Paraburkholderia）、红游动菌属（Rhodoplanes）、黄色土源菌属（Flavisolibacter）和酸杆菌属（Acidobacterium）的相对丰度较高；CK2-100中Candidatus Nitrosotalea、unidentified OPB35 soil group、丰佑菌属（Opitutus）和Aquicella的相对丰度较高。

表4 属水平上土壤原核微生物的相对丰度分析Tab.4 Relative abundances of major soil prokaryotic microbes at genus level （%）

图3 属水平上原核微生物物种丰度聚类热图Fig.3 Heatmap of relative abundances of soil prokaryotic microbes at genus level

3 讨论

本研究中发现，不同用量万寿菊秸秆熏蒸后植烟土壤细菌和放线菌数量均有所增加，这与其应用于连作苹果土壤上的研究结果一致［14］。在4种用量中，万寿菊秸秆1 500 kg/hm2的添加量在增加土壤细菌和放线菌数量中的作用最为显著，低添加量（750 kg/hm2）的熏蒸效果不理想可能是由于添加量不足所造成的；高添加量（2 250 kg/hm2和3 000 kg/hm2）则可能会由于植物材料过多而没有充分腐解，导致土壤透气性不良、土壤颗粒黏结［14］，进而刺激病原菌的生长［20］。

土壤微生物多样性是表征土壤稳定性与质量的重要指标。微生物群落多样性和丰富度指数越高，群落结构越趋于稳定［21］。烟草连作5年后，土壤微生物群落的多样性显著降低，逐渐趋于单一化［22］。本研究结果表明，万寿菊秸秆（1 500 kg/hm2）熏蒸提高了土壤原核微生物群落尤其是烟苗移栽后50 d时的土壤原核微生物群落Sobs、Shannon和Chao1指数，这与水稻秸秆还田、油菜绿肥翻压等提高烟草根际微生物群落多样性的作用相似［23］，有利于避免微生物种群趋于单一化，提高土壤微生物群落结构的稳定性。

万寿菊秸秆（1 500 kg/hm2）熏蒸可显著提高土壤中芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）的相对丰度，有利于更好地抑制土传病原菌的定殖，促进植物的健康生长［15，24-25］。属水平上的土壤原核微生物群落构成在万寿菊秸秆（1 500 kg/hm2）熏蒸后也发生了变化，烟苗移栽后50 d时土壤中拮抗 菌（Sphingomonas、Pseudomonas、Gemmatimonas、unidentified Gemmatimonadaceae、Lysobacter）以及降解菌（Ramlibacter）的相对丰度明显提高，这些原核微生物有利于抑制土传病原菌对烟草生长的危害［26-30］，降解土壤中多环芳烃物质，减轻化感自毒物质对根系的损伤［31］；烟苗移栽后100 d时土壤中拮抗菌（Burkholderia）、功能菌（Candidatus Solibacter、Bryobacter和Rhizomicrobium）、根际促生菌（Flavisolibacter）相对丰度也较高，这些原核微生物有利于抑制土传病原菌，同时可分解土壤有机质、促进土壤碳循环，为烟株生长提供足够的营养，促进烟株根系发育［32-34］。万寿菊秸秆熏蒸提高根际土壤中这些有益菌相对丰度的原因可能是万寿菊秸秆中含有丰富的纤维素和木质素［35］，可为土壤微生物的活动提供丰富的碳源和氮源，促进微生物的生长和繁殖，从而改善土壤微生物结构［36］。

本研究中将万寿菊秸秆粉碎，分析并证实了万寿菊秸秆熏蒸在改善植烟土壤原核微生物群落结构中的作用，而有关万寿菊秸秆的其他利用方式是否也具有同样的作用效果还有待进一步研究。

4 结论

万寿菊秸秆熏蒸（750～3 000 kg/hm2）可增加烟株根际土壤细菌和放线菌数量，以1 500 kg/hm2的用量效果最明显。万寿菊秸秆熏蒸（1 500 kg/hm2）可提高根际土壤原核微生物群落Shannon多样性指数和Sobs、Chao1丰富度指数，增加拮抗菌、降解菌、功能菌和根际促生菌的相对丰度，在改善连作烟田土壤微生物群落结构中具有积极作用，同时具有缓解烟草连作障碍的潜在作用。