GC-MS法分析烟用香精中10种有机酸

汤晓东，苏燕，张丽娜，陈晓水，蒋佳磊，朱书秀，杨君

浙江中烟工业有限责任公司技术中心，杭州市西湖区转塘镇科海路118号310024

烟用香精是一类重要的烟草添加剂，根据其施加工艺与作用的不同分为加香香精和加料香精。卷烟企业通过在加香、加料工艺中添加不同的香精以改善卷烟品质。烟用香精成分复杂，而有机酸是其中重要的组成部分。烟用香精中有机酸分为挥发性有机酸、半挥发性有机酸和非挥发性有机酸［1］。半挥发性有机酸和非挥发性有机酸是影响烟草吸食品质的主要化学成分之一，其在卷烟燃烧过程中具有平衡烟气的酸碱度、减轻烟气的刺激性、增加烟气浓度的作用，对卷烟的抽吸品质具有重要影响［2-4］。因此，准确分析烟用香精中半挥发性有机酸和非挥发性有机酸的种类和质量分数，对了解各种香精内在品质及设计香精配方具有重要意义。

近年来，对于有机酸的测定主要集中在食品［5-6］、饮料［7-8］、烟草及烟草制品［9-11］等领域，分析方法主要有GC法和HPLC法。GC法是目前测定非挥发性有机酸最常用的方法，该法需要经过水解、皂化、酯化、提取等前处理过程；HPLC法多采用将有机酸衍生成具有紫外吸收的物质后用紫外检测器检测，或采用荧光法检测［12］。目前，有关香精中有机酸的分析研究鲜见报道，王军等［13］采用10%（体积分数）硫酸甲醇溶液于80℃下加热回流烟用香精样品，使其中的有机酸与甲醇充分反应成酯，然后将二氯甲烷萃取液经无水硫酸钠干燥后，采用GC法检测。该方法在实际应用时存在以下缺点：①部分烟用香精经高温回流衍生后，用二氯甲烷萃取会出现乳化现象，不利于后期的仪器分析；②采用气相色谱-火焰离子化检测器分析复杂样品时会出现“假阳性”的情况；③对于大批量样品的分析，该衍生化方法效率较低。因而有必要建立一种简便灵敏的、适合于批量分析烟用香精中有机酸的方法。因此，本研究中以含硫酸的甲醇溶液在室温下静置反应的方式对香精中有机酸进行衍生化，优化了衍生化反应条件，以GC-MS-SIM法测定有机酸的质量分数，建立了一种简便、灵敏、准确测定烟用香精中有机酸的方法，旨在为香精中有机酸的检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

香精样品1#～26#，其中1#～15#为加料香精样品，16#～26#为加香香精样品，由浙江中烟工业有限责任公司提供。

草酸（标准品，99.999%，美国Aldrich公司）；丙二酸、棕榈酸（99.5%），硬脂酸（99.2%），琥珀酸（96.5%），亚油酸（98.0%）（标准品，美国Chem Service公司）；DL-苹果酸（标准品，＞99.0%，日本东京化成工业株式会社）；柠檬酸（≥99.5%），油酸（≥99.0%），亚麻酸（≥98.5%）（标准品，美国Sigma-Aldrich公司）；己二酸（标准品，≥99.5%，美国Sigma公司）；甲醇、二氯甲烷（色谱纯，迪马科技有限公司）；硫酸（95.0%～98.0%，西陇科学股份有限公司）。

7890A/5977A型气质联用仪、HP-INNOWAX色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）（美国Agilent公司）；XP205型电子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司）。TALBOYS涡旋振荡混合器（美国Henry Troemner公司）；4-16K离心机（德国Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准工作溶液的配制

（1）内标溶液和单一标准品储备液。准确称取1 000 mg（精确至0.1 mg）己二酸，加入100 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成浓度为10 mg/mL的内标溶液。分别准确称量100 mg草酸、50 mg丙二酸、50 mg琥珀酸、400 mg苹果酸、50 mg棕榈酸、100 mg柠檬酸、50 mg硬脂酸、300 mg油酸、300 mg亚油酸和100 mg亚麻酸于10 mL容量瓶中，分别精确至0.1 mg，用甲醇定容，配制成10种有机酸的单一标准品储备液；在0～4℃条件下密封避光贮存。

（2）混合标准溶液。分别准确移取100μL上述单一标准储备液到10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成混合标准溶液1；分别准确移取1 000μL上述单一标准储备液，同法配制成混合标准溶液2。

（3）标准工作曲线。标准工作曲线1：分别准确移取10、25、50、100、250、500μL混合标准溶液1于50 mL离心试管中，用氮气吹干后，加入5 mL 10%（体积分数）硫酸甲醇溶液和50μL 10 mg/mL己二酸内标溶液，振荡摇匀后，静置反应24 h。然后加入10 mL水和5 mL二氯甲烷，旋紧盖子，以2 000 r/min涡旋振荡10 min后，离心5 min，取下层有机相过滤后进行GC-MS分析。标准工作曲线2：分别准确移取50、100、250、500和1 000μL混合标准溶液2于50 mL离心试管中，其余处理过程同标准工作曲线1。

1.2.2 样品处理与GC-MS分析

准确称取1.0 g烟用香精样品，置于50 mL离心管中，加入5 mL 10%硫酸甲醇溶液和50μL 10 mg/mL的己二酸内标溶液。后续处理同标准工作曲线的制作。GC-MS分析条件：

色谱柱：HP-INNOWAX柱；进样口温度：240℃；分流比：10:1；载气：He，99.999%；流量：1.0 mL/min；升温程序：50℃（2 min）240℃（15 min）；溶剂延迟：5 min；电子能量：70 eV；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；传输线温度：240℃。采用选择离子监测方式（SIM）扫描，采用NIST谱库检索并结合标样及目标物的特征离子进行定性，采用特征离子和内标法进行定量。

2 结果与讨论

2.1 定性与定量分析

有机酸衍生物GC-MS分析的定性和定量离子结果见表1。

表1 10种有机酸的保留时间及特征离子Tab.1 Retention time and characteristic ions of 10 organic acids

2.2 色谱柱的选择

对于有机酸甲酯的定量分析，常用的色谱柱是DB-5MS和HP-INNOWAX色谱柱。本研究中对比分析了这两种色谱柱对10种有机酸分离的效果，发现非极性的DB-5MS色谱柱能有效分离其中的8种有机酸，但不能将油酸和亚麻酸分离；强极性的HP-INNOWAX色谱柱可以将10种有机酸完全分离，且峰形尖锐、对称、无拖尾现象（图1）。因此，选择HP-INNOWAX色谱柱用于分离10种有机酸。

2.3 衍生化条件的选择

甲酯化反应的体系通常选择BF3、浓硫酸或碱的甲醇溶液，由于BF3甲醇溶液的毒性较大，故考察浓硫酸甲醇溶液和NaOH甲醇溶液对脂肪酸甲酯化的影响［14］。酸催化甲酯化法适合处理游离型和甘油三酯型的脂肪酸，而碱催化甲酯化法不太适合处理游离型脂肪酸［15］。因此，选择浓硫酸甲醇溶液对有机酸进行衍生化，其中多元酸的所有羧基均会被甲酯化。有机酸的定量分析是否准确，关键在于衍生化的完全程度及样品处理的准确性。本研究中以各有机酸衍生物峰面积与内标衍生物峰面积的比值定量，考察了衍生化温度、时间和衍生化试剂的浓度对有机酸甲酯化程度的影响。

图1 HP-INNOWAX色谱柱对有机酸标准溶液分离的色谱图Fig.1 Chromatogram of standard solutions for 10 organic acids separated by HP-INNOWAX column

2.3.1 衍生化温度的影响

取4份烟用香精样品，每份1 g，各加入5 mL 10%硫酸甲醇溶液和50μL 10 mg/mL己二酸内标溶液，分别于室温和40、60、80℃水浴条件下衍生化2 h，冰浴快速冷却至室温后，加入10 mL水和5 mL二氯甲烷，萃取。1#香精样品在不同温度下用二氯甲烷萃取时的现象见图2。该现象并非个例，经实验验证发现部分香精样品在室温和40℃条件衍生后，用二氯甲烷萃取时分层良好；而在60和80℃下衍生后，用二氯甲烷萃取时出现乳化现象，影响香精成分定量的准确性。为了使该方法的适用性更广，主要分析比对了室温和40℃条件下各有机酸的衍生化效率。由表2可知，相较于室温，除柠檬酸外，大多数有机酸在40℃下的衍生化效率变化不大。因此，考虑到易操作性和安全性，选择室温作为衍生化条件。

图2 不同温度下用二氯甲烷萃取样品后的实物图Fig.2 Pictures of samples extracted with dichloromethane at different temperatures

表2 衍生化温度对有机酸衍生化效率的影响①Tab.2 Effects of temperature on efficiency of organic acid derivatization （%）

2.3.2 衍生化时间的影响

在室温下，考察了衍生化时间（1、5、9、15、18、21、24、27 h）对各有机酸衍生化效率的影响，结果见表3。随衍生化时间的增加，各有机酸的衍生化效率逐渐提高。衍生化时间为21 h时，各有机酸已经基本完全衍生化；继续延长衍生化时间，各衍生化产物的色谱峰面积基本不变。为确保衍生化完全，同时方便实验操作，选择衍生化时间为24 h。

2.3.3 衍生化试剂浓度的选择

文献［16-17］报道衍生化试剂的浓度对脂肪酸甲酯化有极显著影响。在优化后的温度和时间条件下，对比2%、5%、10%、15%和20%硫酸甲醇溶液对各有机酸衍生化效率的影响，结果见表4。可见，硫酸与甲醇的体积比对柠檬酸的衍生化效率影响最大；而V硫酸∶V甲醇=10∶90（体积比）时，各有机酸的甲酯化效果均较好。因此，选择V硫酸∶V甲醇=10∶90作为衍生化条件。

表3 衍生化时间对有机酸衍生化效率的影响①Tab.3 Effects of time on efficiency of organic acid derivatization （%）

表4 硫酸与甲醇的体积比对有机酸衍生化效率的影响①Tab.4 Effects of sulfuric acid-methanol ratios（V/V）on efficiency of organic acid derivatization （%）

2.3.4 衍生化产物的稳定性

取有机酸混合标准溶液按优化条件衍生化，然后进行GC-MS分析；进样后立即4℃冷藏，分别放置8、24、48、72 h后再一次进样。每次进样前取出，室温下放置30 min。结果显示，各有机酸衍生物峰面积与内标衍生物峰面积比值的RSD均小于5.75%。说明这些有机酸的甲酯化产物稳定，适合定量分析。

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线、检出限和定量限

分别对配制的系列标准工作溶液按照优化后的衍生化条件进行衍生，并以目标化合物和内标峰的定量离子峰面积之比与各目标物浓度和内标浓度之比进行回归分析，得到10种目标物的线性回归方程及其相关系数。根据实际样品分析需要，建立了两条标准曲线。以3倍信噪比（S/N=3）计算检测限（LOD），以S/N=10计算定量限（LOQ）。由表5可知，10种有机酸在各自线性范围内线性关系良好（回归方程的R2均大于0.998），10种有机酸的检出限和定量限分别在0.004～0.080和0.013～0.267 mg/kg之间，可以满足各目标物的定量分析要求。

2.4.2 方法的回收率和精密度

在高、中、低3个不同浓度水平进行加标回收率实验，每个添加水平下平行测定6次，计算样品中各有机酸的回收率和RSD，结果见表6。可知，10种有机酸在不同浓度水平下的加标回收率在83.06%～110.29%之间，相对标准偏差在1.01%～6.50%之间。说明本方法的回收率高、精密度好。

表5 10种有机酸的线性参数、检出限及定量限Tab.5 Linear parameters,limits of detection and limits of quantification of 10 organic acids

表6 10种有机酸的回收率和精密度（n=6）Tab.6 Spiked recoveries and precision of 10 organic acids（n=6）

2.5 实际样品的测定

采用本方法分析了26个香精样品，其中1#样品的色谱图如图3所示，26个样品中10种有机酸的检测结果如表7所示。由表7可知，10种有机酸在大多数香精样品中均有检出。所有香精样品中，质量分数较高的有机酸均是苹果酸和柠檬酸，而硬脂酸和亚麻酸的质量分数均较低。总体而言，加料香精组的10种有机酸的总量明显高于加香香精组。

图3 1#香精样品的色谱图Fig.3 Chromatogram of tobacco flavor sample 1#

表7 香精样品中10种有机酸的分析结果Tab.7 Analysis results of 10 organic acids in tobacco flavors （mg·kg－1）

3 结论

①通过优化色谱条件和衍生化条件，采用内标法定量，建立了可同时测定香精中10种有机酸的GC-MS分析方法。②在优化条件下，目标物的检出限和定量限分别在0.004～0.080和0.013～0.267 mg/kg之间，加标回收率在83.06%～110.29%之间，RSD在1.01%～6.50%之间。③实际样品的检测结果显示，10种有机酸在绝大多数样品中均有检出，且其质量分数在加料香精和加香香精样品中差异明显。④该方法操作简便、灵敏度和精密度高，适合于批量测定香精中的10种有机酸，可为烟用香精品质控制提供一种技术手段。