胆南星中猪、牛、羊源性成分实时荧光PCR 检测＊

田妮娜，朱仁愿，刘 荔，邵长春，王月玲，宋玉霞

（1.兰州市食品药品检验所，甘肃 兰州 730050；2.河西学院，甘肃 张掖 734000）

胆南星是一种常用的中药材，为天南星与牛、羊或猪胆汁经加工或发酵而成[1]；有息风定惊、清热化痰之功效，临床上多用于小儿百日咳、癫痫病、中风等疾病的治疗；现行版药典中对胆南星的检测项目包括性状鉴别、显微特征鉴别和理化反应鉴别三项。近年来，关于胆南星的研究颇多，主要是以胆汁中的胆汁酸类成分为指标性成分，采用薄层色谱法、高效液相色谱法等技术研究炮制方法、药效学、质量标准等方面的内容。但是，胆南星中牛羊猪源性成分的检测未见报道。为明确胆南星中胆汁的来源，对胆南星的动物源性进行鉴别。这是因为不同动物、不同组织来源的胆南星，其药效可能存在一定差异。例如，陈江宁等研究发现不同胆汁制备的胆南星胆酸类成分及其解热作用存在差别[2]。同时明确胆南星的种属来源对防止疯牛病、羊瘙痒病等疾病的传播有重要作用。因此，建立鉴别胆南星动物源性的方法对控制胆南星的质量具有重要意义。

此外，关于胆南星伪品多有报道，广州市白云区药检所何倩京发现一种胆南星伪品，采用薄层鉴别方法未检出胆酸、猪去氧胆酸及去氧胆酸[3]；浙江省长兴县中医院沈忠明发现一种深灰的泥土经压制加工而成的胆南星伪品[4]；江苏省泰州市药品检验所仇雅静发现人工伪造的假胆南星，其显微镜下检出大量泥砂及叶、果实组织；由上述可见胆南星伪品较多，市场情况比较混乱[5]。因此，为了能准确的鉴别胆南星的来源与混伪品，建立鉴别胆南星动物源性的方法同样意义重大。

以DNA 为基础的检测方法是目前动物源性检测领域的常用方法。胆南星由牛、羊或猪胆汁制成，故本文拟采用TaqMan 探针法，参照牛羊猪源性成分实时PCR 检测方法[6]，选用实时荧光定量PCR 法对胆南星中牛羊猪源性成分进行鉴定并进行讨论。采用双标记荧光PCR 技术，根据动物种间多态性的差异，对线粒体DNA 基因及内参照同时进行扩增，通过两种不同荧光物质（FAM、VIC）的特异性探针进行鉴定。

1 仪器与材料

艾本德5810R 高速台式离心机，艾本德Biospectrometer Basic 紫外分光光度计，赛默飞世尔科技QuantStudio 7 Flex 实时荧光PCR 扩增仪，牛、羊、猪实时荧光PCR 试剂盒选用takara Real Time PCR Porcine/Ovine/Bovine DNA Detection Kit；提取试剂盒选用TIANGEN 血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒。胆南星，参考《中国药典》的方法，选用天南星加牛、羊、猪胆汁发酵制成。商品胆南星(四川百胜药业有限公司和四川千方中药有限公司)，经兰州市食品药品检验所中药室鉴定为正品。实验中以天南星加鸡胆汁发酵制成的样品作为DNA 提取、扩增阴性对照。

2 方法与结果

2.1 DNA 的提取

将样品打碎后，用试剂盒或核酸提取仪提取DNA，方法如下：取预先处理好的样品约20mg，置于1.5mL 离心管中，加300μl 缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。加入30μl 蛋白酶K 溶液，混匀。置56℃金属浴中过夜至完全裂解，离心，然后用试剂盒或核酸提取仪提取DNA。

2.2 DNA 浓度和纯度的测定

利用紫外分光光度计测量所提DNA 浓度及A260nm/A280nm，经测定，A260nm/A280nm 的值均＞1.7，表明可用于PCR 实验等后续的操作。同时将浓度稀释至2～10ng/μl，于-20℃保存备用。

2.3 引物和探针

采用Premier5.0 引物设计软件，经比对后选取猪、牛、羊的特异性引物和探针，内参基因引物探针序列选用真核生物18SrRNA 基因，均由大连宝生物有限公司合成。

2.3.1 猪朊蛋白基因检测用引物探针序列

5’端引物：5’-TTTGTGCATGCTGCGTCAAC-3’

3’端引物：5’-CTTGGTGGTCGTGGTCACTGT-3’

探针：5’ -FAM -CACCGTCAAGCAGC -(NFQ)(MGB)-3’

2.3.2 羊线粒体细胞色素b 基因检测用引物探针序列

5’端引物：5’-ACACAACTTCTACCACAACCE-3’

3’端引物：5’-AAACAATGAGGGTAACGAGGG-3’

探针：5’-FAM-ACACCGAAACAAAATACTCC TTGAGAAACA-(TAMRA)-3’

2.3.3 牛生长激素基因检测用引物探针序列

5’端引物：5’-CCGATGGATGTTCAGAGCT-3’

3’端引物：5’-GCCAAATGTCTGGGTGTAGAT ACC-3’探针：5’-FAM-TGGGCTTTAGGGCTTCCG AATGAATGTGAA-(TAMRA)-3’

2.4 反应体系与反应条件

反应体系（总体系25μl)：2X Premix 12.5μl，引物、探针和模板DNA1μl。

反应条件：95℃预变性10s，1 个循环；95℃变性5s，60℃退火30s，40 个循环。

2.5 实时荧光PCR 结果判定

PCR 反应完成后以Ct 值判定结果。阳性对照FAM 和VIC 有荧光信号检出，并出现典型的扩增曲线且Ct 值应小于28.0；阴性对照有VIC 荧光信号检出而无FAM 荧光信号检出。若样品Ct 值大于35.0 或无扩增曲线，表明不含所检测的动物源性成分。若样品Ct 值小于等于35.0 并出现典型的扩增曲线，表明含所检测的动物源性成分[7]。

2.6 特异性试验

分别取天南星加牛、羊、猪、鸡发酵的样品，共4份样品，进行荧光定量PCR 特异性检测试验。根据典型扩增曲线和各反应体系循环阈（Ct）值的不同来验证牛、羊、猪源性引物和探针对于不同动物的DNA 模板的特异性。结果如图1 所示，试验结果表明天南星加牛、羊、猪发酵样品的DNA 提取液中分别仅检出相应的动物源性成分，而未检出其他三种动物源性成分。说明本研究建立的检测方法对胆南星牛、羊、猪源性成分检测具有特异性。

图1 牛、羊、猪源性成分特异性试验

2.7 检出限试验

将10ng/μl 的牛羊猪DNA 提取液加灭菌双蒸水开始开始进行10 倍梯度稀释，稀释至最低浓度为0.0001ng/μl，以不同稀释浓度的样品DNA 为模板进行荧光定量PCR 扩增反应程序，进行检出限检测的检测试验。结果如图2 所示，牛羊猪源性成分可检测到的最低样品浓度为0.1、0.001 和0.001ng/μl。

图2 牛、羊、猪源性成分

2.8 动物源性成分检测

分别用牛、羊、猪源检测试剂盒进行实时荧光PCR 反应。结果显示，四川百胜药业有限公司和四川千方中药有限公司各3 批胆南星样品中均不含有牛、羊源性成分，但都含有猪源性成分，结果如图3 所示。

3 讨论

本研究采用的TaqMan 探针实时荧光PCR 方法能有效鉴别胆南星中的动物源性成分。且方法简便，只需配好反应体系，设置好实时荧光PCR 仪的参数即可，免去了常规PCR 检测电泳和DNA 测序等步骤，同时避免了PCR 产物的污染和溴化乙锭带来的危害，反应只需1h[8]，适用于胆南星中的动物源性成分快速鉴别。

不同动物胆汁所含化学成分大体相同，理化鉴别方法很难对胆南星胆汁的来源做出准确判断，而分子鉴别方法在物种鉴别方面优势明显。本研究通过摸索胆南星药材的DNA 提取方法、参照《SN/T 2051-2008 食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR 法》的引物和探针，并对方法的特异性和检出限进行检测，高选择性的扩增出胆南星中动物源性成分的DNA 片段，建立了胆南星动物源性成分检测专属性方法，对明确胆南星中胆汁的来源，胆南星的真伪鉴别，控制胆南星药材质量，促进与该品种相关的中药市场的健康发展有重要意义。