熟地黄酒炖法炮制工艺研究

梁志毅，徐 杰，程学仁，黄梦婷，张志鹏，鲁 云

(广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244)

熟地黄是由玄参科植物地黄(RehmanniaglutinosaLibosch.)干燥的块根经加工炮制而成，味甘，性微温，具有补血滋阴、益精填髓的功效[1]。历史上熟地黄的炮制方法各异，其中以“九蒸九晒”最为常见[2]。由于传统加工工艺繁琐，耗时耗能，不利于工业化生产，近现代熟地黄的炮制多以“清蒸”和“酒炖”为主。

唐慎微的《证类本草》[3]中“光黑如漆，味甘如饴”的描述作为熟地黄质量评价的标准一直从宋代沿用至今，但仅凭感官判定结果作为药材质量评价指标，缺乏科学严谨性，难以实现熟地黄炮制的现代化和标准化。研究表明，熟地黄的炮制过程中，指标成分毛蕊花糖苷的含量会逐渐降低；同时由于“美拉德反应”会逐渐产生糖衍生物5-羟甲基糠醛，其与熟地黄在炮制过程中变黑密切相关[4-7]。

《中国药典》2015版一部对熟地黄炮制项下酒炖法的具体炖制时间、黄酒用量、炮制终点等均未作详尽的说明，缺乏量化指标，不利于熟地黄的质量控制。既要保证熟地黄的充分熟化，达到“黑如漆，甘如饴”的感官标准，又要防止炖制时间过长导致指标成分的过度损失，炮制过程尤为关键。因此，本研究参考“德尔菲法”[8]在药材商品规格评价上的应用，对酒炖法炮制所得熟地黄进行性状评价，同时结合加权法，以性状评价和毛蕊花糖苷、5-羟甲基糠醛及水溶性浸出物的含量为指标进行综合评分，采用正交试验优化熟地黄的酒炖法炮制工艺，以期优选出质量接近传统工艺且适用于现代化生产的酒炖法炮制工艺参数，为熟地黄质量控制研究提供理论指导和技术支持。

1 材料与仪器

生地黄购自民生药业集团豫西中药材物料基地有限公司，经广东一方制药有限公司质量中心鉴定为玄参科植物地黄(RehmanniaglutinosaLibosch.)干燥的块根。毛蕊花糖苷(批号111530-201713，纯度92.5%)、5-羟甲基糠醛(批号111626-201711，纯度99.4%)对照品均购自中国食品药品检定研究院；绍兴黄酒(绍兴柯桥第三酒厂)；色谱级甲醇、乙腈(德国默克股份两合公司)；色谱纯醋酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)；水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

Waters Arc型高效液相色谱仪(包括真空脱气机、二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、TUV 检测器、Empower数据处理系统，美国Waters公司)；MiliQ Direct 8型超纯水机(德国默克密理博公司)；111B型二两装高速中药粉碎机(浙江瑞安市永历制药机械有限公司)；ME203E型分析天平(美国METTLER TOLEDO公司)；KQ-500DE型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 毛蕊花糖苷含量测定[1]

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.1%醋酸水溶液(16 ∶ 84)；流速为1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长334 nm；进样量20 μL。色谱如图1所示。

图1 毛蕊花糖苷对照品(A)、熟地黄样品(B)的HPLC色谱

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取毛蕊花糖苷对照品适量于25 mL容量瓶中，用流动相溶解并定容至刻度，摇匀，得质量浓度为36.93 μg·mL-1的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取熟地黄样品粉末约2.0 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇100 mL，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液50 mL，减压回收溶剂近干，残渣用流动相溶解，转移至10 mL量瓶中，加流动相定容至刻度，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取毛蕊花糖苷对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，以“2.1.1”项下色谱条件进样，以峰面积为纵坐标(y)，进样量为横坐标(x)，得线性回归方程y=63 864x-3 995(R2=1.000 0)，线性范围为0.037～0.739 μg。

2.2 5-羟甲基糠醛含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(5 ∶95)；流速为1.0 mL·min-1；柱温35 ℃；检测波长280 nm；进样量10 μL。色谱如图2所示。

图2 5-羟甲基糠醛对照品(C)、熟地黄样品(D)的HPLC色谱

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取5-羟甲基糠醛对照品适量于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得质量浓度为50.30 μg·mL-1的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取熟地黄样品粉末约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30%甲醇50 mL称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)2 h，放冷，再称定重量，用30%甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取5-羟甲基糠醛对照品溶液1、2、3、5、8、10 μL，以“2.2.1”项下色谱条件进样检测，以峰面积为纵坐标(y)，进样量为横坐标(x)，得线性回归方程y=235 566x-16 701(R2=0.999 9)，线性范围为0.050～0.503 μg。

2.2.5 精密度考察 取正交试验3号熟地黄样品供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，计算5-羟甲基糠醛峰面积积分值的RSD为0.22%，说明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性考察 取正交试验3号熟地黄样品供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、16、24 h进样检测，结果5-羟甲基糠醛峰面积积分值的RSD为2.30%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.2.7 重复性考察 取正交试验3号熟地黄样品，按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件，分别进样检测，结果5-羟甲基糠醛含量的RSD为0.98%，说明方法的重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 取正交试验3号熟地黄样品，精密称取0.5 g，平行6份，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入一定量的 5-羟甲基糠醛对照品后，按供试品溶液制备方法处理并测定含量，计算加样回收率，结果5-羟甲基糠醛的平均加样回收率为96.90%，RSD为2.40%，说明回收率良好。结果见表1。

表1 5-羟甲基糠醛加样回收率试验结果 (n=6)

2.3 水溶性浸出物含量测定

参照2015年版《中国药典》(四部)附录项下(2201)水溶性浸出物含量测定方法(冷浸法)测定。

2.4 正交试验优化熟地黄酒炖法炮制工艺

2.4.1 正交试验因素与水平 选择以闷润时间(A)、黄酒用量(B)、炖制时间(C)为考察因素，各因素设计3个水平，采用L9(34)进行正交设计。因素水平见表2。

表2 正交试验因素与水平

2.4.2 熟地黄性状评分 本研究在对熟地黄传统“光黑如漆，味甘如饴”的感官评价基础上，选择外观性状、断面特征、气味、味道4种指标，以《中国药典》2015版规定的熟地黄外观性状“表面乌黑色、有光泽、黏性大，断面乌黑色、有光泽，气微，味甜”为10分标准，参照“德尔菲法”对正交试验得到的熟地黄外观性状进行评价(评测小组成员由3名主管中药师和3名执业中药师组成；评测方式以自评式“盲法”评价与集中会评相结合)，计算均值；根据各感官指标在熟地黄性状鉴别中的稳定性和可区分性，给予不同的加权系数，对熟地黄性状进行综合评分(综合评分=外观性状/8.4×4+断面特征/9.2×4+气味/9.4×1+味道/9.0×1)，结果见表4。

表4 熟地黄性状评分

2.4.3 正交试验结果分析 根据正交表炮制得到1～9号熟地黄样品，按照“2.1”“2.2”及“2.3”项下方法，分别测定各样品毛蕊花糖苷、5-羟甲基糠醛以及水溶性浸出物的含量，根据各指标在熟地黄炮制工艺选择中的地位，给予不同的加权系数，即性状评分占权重的20%，毛蕊花糖苷的含量占权重的30%，5-羟甲基糠醛的含量占权重的30%，水溶性浸出物含量占权重的20%。求出综合评分(综合评分=性状评分/10×20+毛蕊花糖苷/0.064%×30+5-羟甲基糠醛/0.141%×30+浸出物含量/82.77%×20)，以综合评分值对正交试验结果进行直观分析和方差分析。

直观分析结果表明，熟地黄酒炖法炮制工艺最佳条件应为A1B3C3,，即取100 g生地黄，加50 g的黄酒，隔水炖制8 h。方差分析结果表明，以毛蕊花糖苷、5-羟甲基糠醛、水溶性浸出物的含量为指标进行综合评分时，方差大小为C>A>B，说明蒸制时间对熟地黄中相关指标含量的影响最大，其次是闷润时间和黄酒用量，结果见表5～表6。

表5 正交试验综合加权评分结果

表6 方差分析结果

2.5 炮制工艺验证

称取生地黄药材200 g，平行3份，以正交试验结果评分最高的方法进行炮制，按照“2.1”“2.2”“2.3”以及“2.4.2”项下方法，分别测定各样品毛蕊花糖苷、5-羟甲基糠醛、水溶性浸出物的含量，并进行性状评分，验证实验结果的可靠性，结果3次验证试验炮制所得熟地黄综合评分均值为86.12，RSD=4.33%<5%，表明优化的酒炖法炮制工艺条件合理，稳定可行。结果详见表7。

表7 熟地黄酒炖法炮制工艺验证 (n=3)

3 讨论

传统熟地黄“九蒸九晒”的炮制方法操作繁杂、费时耗力，“光黑如漆，味甘如饴”的感官评判标准难以界定；现行版《中国药典》对酒炖法炮制熟地黄的闷润时间、辅料用量、蒸制时间等均未有详细规定，导致市售熟地黄质量参差不齐。作为大宗常用中药材，熟地黄市场需求量大，部分药材销售商为追求利益最大化，或是缩短蒸制时间增大产能，或是减少黄酒用量降低成本，长此以往，严重影响了熟地黄临床用药的安全性和有效性[9]。近年来，已有诸多关于熟地黄“蒸法”炮制工艺的研究报道[10-15]，但尚未有文献结合熟地黄的性状和化学成分，针对《中国药典》规定的酒炖法进行炮制工艺的优化探索。

本研究参照“德尔菲法”在中药材商品规格评价上的应用，结合加权法，对正交试验设计炮制所得熟地黄的性状进行综合评分，使优化后的酒炖法炮制工艺所得熟地黄能够满足传统“光黑如漆，味甘如饴”的感官标准；优选的酒炖法炮制工艺所得熟地黄毛蕊花糖苷和水溶性浸出物的含量均远高于药典标准，5-羟甲基糠醛的含量适中，达到《大韩药典》规定“以干品定量时5-HMF含量应大于 0.1%”的限度[16]。经过3批工艺验证试验证明，基于多指标综合评分-正交试验法优化的酒炖法工艺合理、稳定可行，可以为熟地黄现代化炮制生产提供理论指导。当然，仅以毛蕊花糖苷和5-羟甲基糠醛作为熟地黄质量控制的指标成分，存在一定的局限性。研究表明，5-羟甲基糠醛具有神经毒性，过量可能与人体蛋白质结合产生积蓄中毒，对人体横纹肌及内脏造成损害[17]，因此熟地黄炮制过程中5-羟甲基糠醛的限量有待确定。环烯醚萜类、还原糖类成分在炮制过程中的含量变化以及《中国药典》规定熟地黄炮制项下“酒炖法”与“蒸法”存在的差异性有待深入研究。