顶空固相微萃取/气质联用（HS-SPME/GC-MS）对奶牛大肠杆菌性乳腺炎诊断方法的建立

武守艳，董春光，杨丽华，韩文儒，刘文俊，陈剑波，韩一超

（山西农业大学山西省农业科学院畜牧医研究所，太原030032）

0 引 言

固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)技术是20世纪90年代兴起的一项新颖的样品前处理与富集技术，是在固相萃取技术上发展起来的一种微萃取分离技术，是一种集采样，萃取，浓缩和进样于一体的无溶剂样品微萃取新技术。固相微萃取技术几乎可以用于气体、液体、生物、固体等样品中各类挥发性或半挥发性物质的分析。

奶牛大肠杆菌性乳房炎是奶牛的常见多发性疾病，严重影响奶牛养殖业的经济效益[1]。细菌挥发性代谢产物是细菌代谢产物的重要组成部分，与细菌生命活动和细菌生长数列密切关联，是细菌与周围各种生物进行交流的重要信息素[2]。大多数细菌释放的挥发性代谢物都具有微生物种属特异性[3-4]，所以，细菌挥发性代谢产物作为一种新的检测靶标成为了诊断细菌感染的有效方法[5-6]。应用顶空固相微萃取/气质联用（HS-SPME/GC-MS）技术分析大肠杆菌污染鲜牛乳产生的特征性挥发代谢产物组，为奶牛大肠杆菌性乳房炎的早期诊断方法的建立提供理论基础。

1 实 验

1.1 材料与试剂

全脂巴氏杀菌乳，市售；营养琼脂培养基，大肠杆菌标准菌株ATCC25922，购自中国兽药监察所；无菌发酵管，实验室自制；无菌顶空进样瓶、20 mL装有倒立发酵管的营养肉汤培养基，实验室自制。

1.2 仪器与设备

TRACE 1300ISD型（GC-MS）气相色谱质谱联用仪，美国Thermo公司；SPME手柄及50/30 um DVB/CAR/PDMS(二乙基苯/碳分子筛//聚二甲基硅氧烷)萃取头。

1.3 试验方法

1.3.1鲜奶的无菌检验

在无菌条件下取市售的鲜牛奶1 mL，转移至20 mL含倒立发酵管的营养肉汤培养基试管中，加盖密封，振荡混匀，排尽倒立管中的空气，试验设4个平行管，然后置于37℃的恒温培养箱中培养24 h。

1.3.2菌液的制备

取-80℃保存的大肠杆菌接种于营养琼脂培养基，37℃培养24 h后可见生长良好的凸起、光滑、湿润、乳白色、边缘整齐或不太整齐的中等偏大菌落。

利用0.5号麦氏比浊管制备1.5×108CFU/mL的大肠杆菌菌液，经梯度稀释后得到1.5×107CFU/mL的大肠杆菌菌液备用。

1.3.3待检样品的制备

用无菌移液管移取9 mL鲜奶加入1 mL浓度为1.5×107CFU/mL大肠杆菌菌液，制备成1.5×106CFU/m L的大肠杆菌污染的牛奶样品，以同样的方法制备1.5×105CFU/mL、1.5×104CFU/mL、1.5×103CFU/mL四个梯度浓度大肠杆菌污染的牛奶样品。

分别用4个无菌移液管移取3 mL上述大肠杆菌污染的牛奶样品置于无菌顶空进样瓶中，每个浓度做3个平行管，同时用1个无菌移液管移取3 mL无菌鲜牛奶置于无菌顶空进样瓶中作为空白对照。

空白对照于4℃保存，菌液污染的牛奶均在37℃下培养24 h，然后同时应用HS-SPME/GC-MS技术进行测定。

1.3.4 HS-SPME/GC-MS检测条件

萃取条件：45℃加热10 min，吸附20 min，解吸附5 min。

进样：把SPME缓慢插入GC-MS进样口进样，解吸5 min。

进样口温度270℃，分流比10∶1，载气为氦气，流速1 m L/min，色谱柱Thermo（30 m×0.25 mm×0.25μm），升温程序：40℃保持3 min，5℃/min升到150℃，10℃/min升到250℃，保持5 min，整个程序40 min。质谱条件：EI离子源，离子源温度：280℃，传输线温度：280℃，扫描质量范围：45～500 amu。

2 结 果

2.1 鲜奶无菌检验结果

鲜奶置于37℃的恒温培养箱中培养24 h后，结果可见4支试管的倒立管中均无气泡产生，证明鲜奶样品无细菌污染。

2.2 HS-SPME/GC-MS检测结果

采用顶空固相微萃取气相色谱-质谱联用(HS-SPME/GC-MS)技术检测的不同浓度大肠杆菌污染的牛奶和空白鲜牛奶的挥发性物质的图谱见图1～5。

图1 空白鲜牛奶的挥发性代谢产物GC-MS谱图

图2 大肠杆菌（1.5×106 CFU/mL）污染的鲜牛奶挥发性代谢产物GC-MS谱图

图3 大肠杆菌（1.5×105 CFU/mL）污染的鲜牛奶挥发性代谢产物GC-MS谱图

图4 大肠杆菌（1.5×104 CFU/mL）污染的鲜牛奶挥发性代谢产物GC-MS谱图

图5 大肠杆菌（1.5×103 CFU/mL）污染的鲜牛奶挥发性代谢产物GC-MS谱图

从上图可以看出，大肠杆菌污染的鲜牛奶谱图与空白鲜牛奶的谱图中的峰高度不同且有新峰出现，说明两组的挥发性代谢产物具有一定的差异。且随着感染细菌浓度的降低,产生的挥发性代谢产物的量也随之减少。

应用NIST MSSearch 2.0质谱数据库的质谱数据进行计算机检索比对，并对检索结果进行解析，结果见表1。

表1 大肠杆菌污染的牛奶和空白鲜牛奶的挥发性物质差异

从表中可知，空白鲜牛奶组和大肠杆菌污染的牛奶组共同的挥发性物质有2-庚酮、2-壬酮、2-十一酮；空白鲜牛奶组特有的挥发性物质为角鲨烯；大肠杆菌污染的牛奶组特有的挥发性物质为乙醇、乙酸、苯并噻唑、正辛酸、正癸酸。

3 讨 论

本试验结果大肠杆菌污染鲜奶产生的乙酸和乙醇都是在大肠杆菌发酵时代谢葡萄糖产生的代谢产物，反 应 方 程 式 为：C6H12O6→2C2H5OH+2CO2，C6H12O6→2CH3CH2OH+2CO2。辛酸和癸酸的产生与试验牛奶样品的来源有关，市售巴氏杀菌牛奶中还添加了一些食品添加剂，该牛奶的成分与直接从奶牛身体挤出来的牛奶会有一些不同。苯并噻唑的产生推测在大肠杆菌发酵时利用牛奶中的糖和氨基酸产生的中间代谢产物通过两个合成路线合成的，第一是二氨基苯硫醇+乙氧基乙醛二乙基乙缩醛→苯并噻唑，第二是乙氧基乙醛二乙基乙缩醛→苯并噻唑。

从试验结果可以看出，大肠杆菌污染的牛奶与无菌牛奶挥发性代谢物有明显的差异，大肠杆菌污染的牛奶可以产生乙醇、乙酸、苯并噻唑、正辛酸、正癸酸这些特异性物质，可用于检测大肠杆菌污染的牛奶。

固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)技术是20世纪90年代兴起的一项新颖的样品前处理与富集技术，顶空(固相微萃取)技术的特点是对于一些挥发性组分以及半挥发性组分灵敏度较好，能得到稳定可靠地定性定量结果；对于一些含量较低，低挥发性的组分来说，固相微萃取技术能有效的起到一个富集的作用。现已在环境、生物、工业、食品、临床医学等领域的各个方面得到广泛的应用，该技术应用前景广泛。

顶空(固相微萃取)技术的基本原理简单来讲，顶空就是一种进样方式。将待测样本置于一恒温密闭容器中，通过加热升温使得挥发性组分从样本中挥发出来，在顶空瓶里面的气液(气固)两相中达到热力学平衡之后，直接抽提顶部气体打入气相色谱质谱仪器中进行分离分析，从而进行一些挥发性或者气味物质的检测的原理。固相微萃取技术的作用就是在抽提气体样本的时候采用涂有固定相的熔融石英纤维来进行吸附、富集，然后再解吸进样的这样一个原理；顶空(固相微萃取)技术主要用于气体，液体或者固体样本中挥发性组分或者半挥发性组分，气味物质，香味物质的检测。

微生物的挥发性代谢产物是微生物代谢产物的重要组成部分，是人类了解微生物生命活动本质规律的重要窗口,也是提高微生物利用价值的重要物质基础。近年来随着科学技术的发展，奶牛乳房炎的诊断技术不断发展，因此，基于细菌挥发性代谢产物具有微生物种属特异性这一特征，本实验研究为开辟奶牛细菌性乳房炎新型诊断技术提供了坚实的理论基础，使得顶空固相微萃取/气质联用（HS-SPME/GC-MS）技术在疾病诊断中得到广泛的应用。