LC-MS/MS测定牛奶中氟虫腈及代谢物残留量

王永芳，娄婷婷，温华蔚，周磊

（1.天津海关动植物与食品检测中心，天津300457；2.天津海关 工业产品安全技术中心，天津300457）

0 引 言

氟虫腈是一种苯基吡唑类农药[1，2]。氟虫腈经水解及光解作用，生成氟虫腈亚砜、氟虫腈砜、氟甲腈[3]，相关部门对氟虫腈及代谢物的毒性及对环境友好度进行了评估[4-5]，氟虫腈代谢产物的毒性比母体大很多[6]，使用不当会损害肝脏、肾脏等，我国于2009年10月1日起禁用氟虫腈，欧盟一些国家也要求禁止使用氟虫腈进行防虫[7-8]。

我国禁止在用于食品加工的动物养殖过程中使用氟虫腈。国际上，牛奶中氟虫腈最大残留限量要求如下：《日本肯定列表》为0.02 mg/kg；欧盟(EU)No750/2010为0.005 mg/kg。国内GB 2763-2019中明确了氟虫腈在生乳中的限量[9]，该限量标准对氟虫腈检测的相关标准中未指定生乳的检测方法[10-13]，且目前我国未制定乳制品中氟虫腈残留量检测的相关标准。目前检测氟虫腈的文献[14-20]越来越多，其中检测方法涉及到动物源性食品的基质大部分为鸡蛋和禽肉类，牛奶基质较少。本文采用乙腈提取，PEP Plus萃取柱进行净化，能快速准确地测定牛奶中氟虫腈及代谢物的含量。

1 实 验

1.1 材料和仪器

乳制品：牛奶、奶粉（市售）；氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜，纯度＞98.0%，德国Dr.Ehrensorfer公司；乙腈、正己烷、丙酮，色谱纯级，迪马科技；乙酸铵(＞98.0%)，氯化钠（＞99.5%）；国药集团化学试剂有限公司；甲酸（色谱纯）、Cleanert PEP Plus（60 mg/3 m L），博纳艾杰尔；Florisil固相萃取柱(1 g/6 mL)，色谱科；C18固相萃取柱（150 mg/3 mL），博纳艾杰尔。

液相色谱串联质谱仪，安捷伦1290-6460；AL204-IC型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；Promax-2020型水平往复振荡器，德国Heidolph公司；XH-D型涡旋混合器，上海汗诺仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1标准溶液配制

准确称取10.0 mg标准物质,用乙腈溶解，配制成质量浓度1 mg/mL的标准溶液，于-20℃冰箱进行保存。根据检测需要，用乙腈逐级稀释至所需浓度。

工作液的配制。选择空白牛奶基质，取适量氟虫腈及代谢物混合标准溶液配制成一系列浓度的工作液，现用现配。

流动相配制。10 mmol乙酸铵-0.1%甲酸-水溶液：称取乙酸铵0.78 g，溶解于1 L高纯水中，再加入1 mL甲酸，摇匀，常温保存，现用现配。

1.2.2色谱条件

色谱柱：Eclipse C18，100 mm×2.1 mm，1.7μm；流速为0.3 mL/min；柱温为30℃；进样量为10μL；流动相为流动相A：0.1%甲酸乙腈；流动相B：10 mmol乙酸铵和0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱程序：0～1 min，10%A；1～7 min，100%A；7～8 min，10%A。

1.2.3质谱条件

离子化模式：电喷雾离子源，负离子模式扫描；检测方式：多反应监测模式；电喷雾电压：4 000 V；雾化气压力：40 psi；离子源温度：350℃；其他参数如表1所示。

表1 氟虫腈及其代谢物质谱参数

1.2.4样品前处理

1.2.4.1样品提取

取5 g牛奶(精确至0.01 g)试样于50 mL离心管中，加入含1%甲酸乙腈10 mL，加入2 g的NaCl，涡旋混匀后，进行超声提取10 min，转速为5 000 r/min离心5 min，上清液待净化。

1.2.4.2样品净化

取上述待净化提取液2 mL，加入到PEP Plus萃取柱中，前0.5 mL流出液弃去，收集剩余的上样流出液。过0.22μm过滤膜，上机测定。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法的优化

本实验牛奶基质中主要成分为水，还含有蛋白质、脂肪、乳糖及矿物质等，其中的蛋白质、脂肪和一些维生素会干扰目标物的提取。关于动物源性食品中氟虫腈残留量的测定的文献[21-22]中提取试剂均选择了乙腈，由于丙酮和乙酸乙酯在提取目标物的同时，会萃取出含量较高的脂肪，不利于下一步净化处理，而乙腈在提取过程中，加入1%甲酸能很好的沉淀蛋白[23]，减少脂肪和其他杂质的溶出，能减少基质对氟虫腈及其代谢物的干扰，加入适量NaCl盐析后更好地进行净化。本实验采用含1%甲酸的乙腈作为提取溶剂。

2.2 净化方法的选择和优化

牛奶中含有蛋白质和脂肪等成分，经过乙腈提取后，通过过净化，能更好的去除杂质的干扰，同时减少提取液中杂质对检测仪器的污染。本研究中选择Cleanert PEP Plus固相萃取柱，Florisil固相萃取柱、Waters Oasis PRiME HLB净化柱，氨基石墨复合柱4种净化柱进行试验比较。本研究中Florisil固相萃取柱、Waters Oasis PRiME HLB净化柱，氨基石墨复合柱需进行活化和洗脱，Cleanert PEP Plus固相萃取柱直接对提取液进行净化。从目标物的回收率实验和实验净化所需时间综合分析，氨基石墨复合柱和Cleanert PEP Plus固相萃取柱回收率相当，回收率在80%以上，氨基石墨复合柱需要活化洗脱，所需时间是Cleanert PEP Plus固相萃取柱净化时间的5倍时间，Florisil固相萃取柱、Waters Oasis PRiME HLB净化柱回收率偏低，综上最终选择Cleanert PEP Plus净化柱进行实验。4种净化柱的回收率如图1所示。

图1 不同净化柱对氟虫腈及其代谢物回收率的影响

2.3 液相和质谱条件的优化

氟虫腈及其代谢物的极性为弱极性，查阅相关文献[24-27]，比较C8和C18色谱柱，如图2所示，从目标物分离程度及峰形比较，Eclipse C18色谱柱对目标物的分离效果和峰形较好，最终选择Eclipse C18色谱柱，考虑到样品基质中杂质的干扰，为使目标化合物获得较好的分离和峰形，降低基质效应的干扰，对下列几种流动相进行比较：A:0.1%甲酸乙腈-10 mmol/L乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）；B：乙腈-水；C：甲醇-水，如图3所示，通过对流动相进行考察，甲醇-水（C），目标物分离程度不如乙腈-水(B)、0.1%甲酸乙腈-10 mmol/L乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）(C)两种流动相，通过相应强度进行比较，0.1%甲酸乙腈-10 mmol/L乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）（A）使目标物相应强度更好，最终选择乙腈-10 mmol/L乙酸铵水溶液（含0.1%甲酸）作为流动相。

图2 氟虫腈色谱

图3 3种不同流动相氟虫腈的色谱

氟虫腈及代谢物的分子结构中有较多的氟、氯等卤代基，在电离过程中，分子中易失去氢质子，形成负离子，所以本方法在电喷雾离子源（ESI）下采用负离子模式进行扫描。选择多反应监测模式进行分析。首先对目标物进行一级质谱分析，确定出4种目标物的母离子，在MS2 SIM扫描模式下优化毛细管出口电压（Fragmentor）参数，按照优化出的参数进行二级质谱分析，通过Product Ion扫描模式进行分析，选取信号最强的两个子离子，通过MRM扫描模式进一步优化，确定为各自的定量参数，见表1。按上述优化的前处理参数和仪器参数进行实验，见图4～5。

图4 空白牛奶样品多反应监测（MRM）色谱

图5 空白基质中添加1μg/kg水平4种化合物的MRM色谱

3 方法验证

3.1 基质效应的考察

在选用质谱进行样品分析时，会存在基质效应（matrix effect,M E）问题。空白基质配制的标准曲线的斜率与溶剂配制的标准曲线的斜率相比，比值越接近1，说明基质效应越不明显，通常采用同一样品的空白基质配制曲线进行校正定量，或者选用稳定同位素内标法等方法减少基质效应的干扰[28]。本方法选择空白牛奶基质，用该空白基质溶液和纯试剂甲醇分别配制一定梯度浓度的标准曲线，斜率比值如表2，通过表2，可以看出，氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜和氟虫腈亚砜在牛奶基质中的基质效应可以接受，基质效应不是很明显，本实验为降低基质效应的影响，选用相应的空白基质配制曲线，对数据进行处理。

表2 氟虫腈及其3种代谢物在牛奶基质中的基质效应 %

3.2 方法的线性及灵敏度

在空白牛奶基质中，分别添加质量分数为1，2，5，10，20，50μg/kg梯度水平制作基质曲线，氟虫腈及代谢物曲线的线性关系良好，R2均大于0.99，各化合物的定量离子的信噪比均大于10，氟虫腈及代谢物的定量限为1μg/kg，以3倍信噪比确定为定性限，氟虫腈及代谢物的定性限为0.6μg/kg，线性方程、相关系数R2等参数见表3。

3.3 方法的准确度和精密度

在空白牛奶样品，分别添加1，2，5μg/kg 3个质量分数，每个质量分数进行6平行实验，氟虫腈及代谢物的回收率为82.5%～97.4%，变异系数4.0%～10.5%范围内，见表4。其结果符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的相关要求。

3.4 实际样品分析

从超市购买20批次牛奶样品，按照优化的检测方法进行样品处理检测，该20批次牛奶样品中均未检测出氟虫腈及3种代谢物。

表3 氟虫腈及代谢物的线性方程、相关系数、线性范围、检出限、定量限数据

表4 方法的平均回收率和精密度（n=6） %

4 结 论

本研究优化了样品前处理萃取试剂参数，选择酸化乙腈进行提取，优化了净化参数，选择Cleanert PEP Plus固相萃取柱进行净化，优化了色谱及质谱参数，建立了LC-MS/MS法测定牛奶中氟虫腈及其三种代谢物的测定方法。该方法的回收率、精密度、线性、测定低限等均满足相关标准的技术要求，适用于牛奶中氟虫腈及代谢物的快速检测。该研究方法优点：定量限低于国内外牛奶中氟虫腈限量值，完全满足限量检测需求，其次，该方法检测效率高，酸性乙腈提取效率高，净化柱无需活化，优化后的仪器条件等因素大大缩短了检测目标物的时间，便于对大批量牛奶中氟虫腈进行快速筛查。国家强制标准GB 2763-2019中规定了生乳的限量，但没有相关的检测标准，该方法的建立可以为建立相关标准提供数据参考，同时也可以为相关执法部门提供技术支撑，从而保障进出口乳制品的质量。