用超滤法提升兽用黄芪多糖注射液质量

石 异，喻 勇，佘 宁

（1.四川齐全红动物药业有限公司，四川遂宁 629000；2.四川齐全农牧集团股份有限公司，四川遂宁 629000）

黄芪多糖注射液具有益气固本，诱导产生干扰素，调节机体免疫功能，促进抗体形成等功效，因此，在畜禽业中常作为免疫增强剂应用。又因黄芪多糖注射液来源于中药材黄芪，符合我国食用性动物药品低毒、无残留、高效药物发展方向，为人们提供安全、营养、无公害的绿色食品。因此，提高黄芪多糖注射液的质量，具有一定的现实意义。目前黄芪多糖有多种提取方法水煎煮法、水浸提法、水回流提取法、碱水提取法、醇除水提法、碱醇提取法、微波提取法、超声提取法、超高压提取法、酶提取法以及联合提取等[1]。其中水煎煮法是提取黄芪多糖的经典工艺，也是《中华人民共和国兽药典》2015 版二部规定制法。该工艺根据大多数多糖在热水中溶解度较大而在高浓度醇中溶解度小的性质提取，简单易行，能够去除不溶性杂质。但以往研究发现，水煎煮法提取的黄芪多糖纯度较低，对提取物选择性较差，提取物成分类别较多，不利于后续分离纯化。

黄芪多糖是复杂生物大分子，不同提取方法和提取条件得到的黄芪多糖分子量、单糖和生物学活性都不相同[2-6]。而黄芪多糖水解后低分子量（10000-21000）多糖产物提高免疫作用更加突出[7]。因此，黄芪多糖的提纯及低分子量化是提高兽用黄芪多糖注射液的一个重要过程。

目前，黄芪多糖纯化有超滤法、纤维素凝胶柱层析、聚酰胺吸附、大孔吸附树脂吸附等。其中，纤维素凝胶柱层析对黄芪多糖纯化度最高，达89%[8]。但纤维素凝胶柱层析对原料预处理要求高，生产成本高[9]。大孔吸附树脂吸附纯化、聚酰胺吸附纯化都需要乙醇进行洗脱[9～10]，乙醇浓度超过10%肌内注射或皮下注射刺激性大[11]。超滤法则是一项新兴的高效分离技术，能有效分离溶液中的大小分子，控制所得产品相对分子量分布，而且有浓缩作用，能提高有效成分浓度，减少剂量。与通常分离提纯方法相比，超滤具有不必经过相转换、不需要添加化学试剂等优点[12]。本文用《中华人民共和国兽药典》2015 版二部中检测黄芪多糖注射液生物活性的方法，运用超滤技术对黄芪多糖注射液进行超滤，并观察未经超滤的黄芪多糖注射液和经过超滤黄芪多糖注射液对小鼠生物活性的影响，以初步验证超滤法能提高兽用黄芪多糖注射液质量的假设。

1 试验材料

1.1 药物

内蒙黄芪，购于四川全泰堂中药科技有限公司；生理盐水，四川科伦药业有限公司。无水葡萄糖、浓硫酸、苯酚，均为分析纯。

1.2 仪器

电子分析天平，AE-240 型，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；紫外-可见分光光度计，UV-2450，岛津（上海）实验器材有限公司。

1.3 动物

昆明种健康小鼠，SPF 级，体重（18±2）g，雄性，购于四川省实验动物专委会养殖场；SPF级全价饲料，购于四川省实验动物专委会养殖场。屏障环境饲养，环境温度24～27℃，相对湿度45%～55%；垫料每周更换3 次，提供充足的无菌饮水。

2 试验方法

2.1 制剂的制备

对照品：称取黄芪饮片150g，加六倍水煎:2次，每次1.5h，合并滤液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.14～1.18（25℃）。浓缩液放至室温，加乙醇使含醇量为约50%，边加边搅拌，静置过夜，除去上清液（回收乙醇）。沉淀加水搅拌溶解，加乙醇使含醇量为35%，搅拌均匀,静置，离心，除去沉淀，上清液再加乙醇至含醇量为70%，静置，取下层沉淀，干燥，得黄芪多糖粉。取黄芪多糖粉，加水溶解，滤过，调节PH 值，测定黄芪多糖含量，加适量注射用水使黄芪多糖含量达1%，灌装，灭菌，制备为以葡萄糖（C6H12O6）计的规格为10ml：0.1g的黄芪多糖注射液。

样品：重复样品操作步骤至调节PH 值，然后将黄芪多糖水溶液用焦光联[13]等超滤提取黄芪多糖的装置进行超滤，滤液加适量注射用水使黄芪多糖含量达1%，灌装，灭菌，制备为以葡萄糖（C6H12O6）计的规格为10ml：0.1g 的黄芪多糖注射液。

2.2 黄芪多糖注射液的定量分析

对照品溶液的制备：取100℃干燥至恒重的无水葡萄糖0.3g，精密称定，置100ml 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml 置50ml 量瓶中，加水至刻度、摇匀，即得。

供试品溶液的制备：精密量取本品3ml（如有沉淀，需先加热溶解、放冷），置100ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

测定法：精密量取对照品溶液与供试品溶液各2ml，分别置于25ml 量瓶中，精密加入5%的苯酚（新蒸馏）溶液1ml，再迅速精密加入浓硫酸5ml，边加边振摇，放置10min，置水浴加热15min，立即置冰水浴中冷却5min，取出，放至室温。同时做空白试验校正，照紫外-可见分光光度计在490nm 波长处测定吸收度。计算，得出黄芪多糖注射液中黄芪多糖的含量为1.03%；超滤过的黄芪多糖注射液中黄芪多糖的含量为1.02%。

2.3 药理研究

取小鼠30 只，体重为(20±2g)，随机分为三组，第1 组为生理盐水空白组，第2 组为未经过超滤法进行提纯的黄芪多糖注射液对照组，第3 组为经过超滤法提纯的黄芪多糖注射液的样品组。第1、2、3 组均以腹腔注射方式给药，剂量为0.5ml/ 只，连续注射7日，每日1 次，于最后1 次注射24h 后，将小鼠全部处死，称体质量，取脾称重，计算平均脾指数。

3 结果

由表1可以看出，黄芪多糖注射液对小鼠的脾脏增重有促进作用。样品组脾脏指数较对照组脾指数大，两组间差异显著。

表1 腹腔注射黄芪多糖（未提纯、提纯）对小鼠脾脏指数的影响

4 结论

通过化学定性分析，测定制剂中总多糖的含量。表明黄芪多糖注射液采用腹腔注射对小鼠脾增重有明显的促进作用，其中样品组腹腔注射效果明显优于对照组。水煎煮法提取黄芪多糖注射液，工艺简单易行，是目前大部分黄芪多糖注射液生产厂家所采用的制备工艺。虽然对黄芪多糖注射液浓度、剂量进行了一些定量规定。但到底什么浓度，什么剂量对于小鼠脾脏指数效果最明显，还需要进一步研究。