桂枝调和营卫配伍对类风湿关节炎模型大鼠炎症及骨破坏的影响*

彭代平，汤小虎，李东云，丁 喆，周瑞彬

（1.云南中医药大学第三附属医院，云南 昆明 650011；2.云南中医药大学第一附属医院，云南 昆明 650021）

桂枝是发散风寒药，性温，具有调和营卫、温通经脉、散寒止痛的功效。前期文献研究[1]发现桂枝广泛用于治疗痹病的名方中，同时实验研究[2-3]也发现桂枝温通经脉相关配伍对胶原关节炎大鼠模型的血清促炎性因子有下调作用。类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）发病的主要病机是本虚标实，气血亏虚，阴阳失调，营卫失和，风寒湿热邪外侵，经络痹阻而致，营卫气血失和是类风湿关节炎发病的重要环节[4-6]，故在治疗RA时调和营卫很重要。本研究选取桂枝调和营卫配伍组合干预风寒湿痹型类风湿关节炎模型大鼠，观察其对促炎性细胞因子及骨破坏的影响，探讨其防治RA的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级雄性Wistar大鼠80只，体质量（200±20）g，购自成都达硕生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（川）2014-028。于云南省中医医院中心实验室SPF级动物房饲养，环境温度（21±3）℃，湿度（55±5）%，12 h光暗循环至实验结束，饲养期间大鼠可自由获取洁净饮用水和食物，适应性饲养1周后进行实验。

1.2 主要药物与试剂 甲氨喋呤片（2.5 mg，批号：036130413），上海信谊药厂有限公司；桂枝配方颗粒（0.5 g相当生药重 3 g，批号：1306175），白芍配方颗粒（1 g相当生药重 10 g，批号：1307089），赤芍配方颗粒（1.5 g相当生药重 10 g，批号：1307070），当归配方颗粒（4 g相当生药重 10 g，批号：1309148），熟地配方颗粒（4 g相当生药重 10 g，批号：1309107），均为江阴天江药业有限公司产品；牛Ⅱ型胶原购自四川大学；完全弗氏佐剂（BD 公司，货号：263810）；肿瘤坏死因子α（TNF-α）检测试剂盒（BD公司，货号：558535），IL-6检测试剂盒（BD 公司，货号：550319），IL-1β 检测试剂盒（R&D 公司，货号：RRA00）。

1.3 主要仪器 Biofuge Primo R离心机（德国Thermo Scientific Heraeus公司）；酶标仪（美国BioTeK公司）；分析天平（METTLER TOLEDO公司）；电子秤（上海友声衡器有限公司）；YLS-7B足趾容积测量仪（济南益延科技发展有限公司）；光学显微镜（LEICA DM2500）。

1.4 造模及给药 将80大鼠随机选取正常组10只，其余70只建立风寒湿痹CIA模型；将100 mg牛Ⅱ型胶原溶于20 mL（0.1 mol/L）的醋酸中，置于4℃过夜，再与等容积的完全弗氏佐剂混合，制备Ⅱ型胶原终浓度为2.5 mg/mL的混合物，然后用注射器反复抽吸，直至混合物完全、充分乳化，以乳化物滴入水中不松散为度；取乳化后的混合物，于麻醉的大鼠尾根、背部皮内各注射0.1 mL，并压迫注射部位30 s使乳化物吸收完全。正常组给予同等剂量的生理盐水皮内注射。免疫后第14天，参照文献[2]并改进，模拟自然风寒湿环境，建立RA风寒湿痹模型，将造模大鼠置于（7±3）℃冷水中，水深1 cm中站立30 min，同时伴以4～5级风力，每天1次，连续刺激7 d。于免疫后第21天进行关节炎指数评分（AI），AI≥2分即为造模成功[7-8]，并随机分为模型组、桂枝白芍组、桂枝赤芍组、桂枝当归组、桂枝熟地组、甲氨喋呤组，每组10只。根据临床常用剂量（桂枝20 g，白芍20 g，赤芍20 g，当归20 g，熟地30 g）按“人和大鼠之间体表面积折算”等效剂量灌胃给药，即每天给药量：桂枝白芍组3.6 g/kg，桂枝赤芍组3.6 g/kg，桂枝当归组3.6 g/kg，桂枝熟地组4.5 g/kg；甲氨喋呤组1.5 mg/kg，每周给药1次；空白组和模型组给予蒸馏水灌胃；给药容积为1 mL/100g，连续给药21d。

1.5 观察及检测指标

1.5.1 观察大鼠体质量变化 从分组给药当日开始测量体质量，每1周测量1次。

1.5.2 观察大鼠关节炎指数（AI）评分 于给药前及给药7、14、21d各进行1次AI评分，评价方法参照文献[9]。0分：无红斑或肿胀；1分：轻微的红斑和1个趾关节肿胀；2分：红斑和超过1个趾关节的肿胀；3分：红斑和踝部或腕部肿胀；4分：全部红斑以及脚趾和踝部或手指和腕部的肿胀，踝或腕不能弯曲。四肢评分之和（最高分为16分）为AI，分值越高代表关节炎程度越严重。

1.5.3 测量大鼠足爪容积 使用YLS-7B足趾容积测量仪测量大鼠双后足爪容积并于踝关节处标记，给药前及给药7、14、21 d各进行1次大鼠双后足爪容积测量，并采用（双后足爪容积之和/2）计算出每1只后爪的容积。

1.5.4 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6的测定 给药21 d，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血并处死大鼠，待血液凝固后，置离心机于4℃，3 500 r/min，离心10 min后分装血清，采用ELISA法（按试剂盒说明书程序进行操作）检测大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 含量。

1.5.5 大鼠踝关节病理变化 大鼠处死后，取双后肢踝关节，于10%中性缓冲福尔马林进行固定，浸洗、脱钙、脱水、透明、石蜡包埋、切片后苏木素-伊红（HE）染色，光镜下观察踝关节的病理变化。

1.6 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析，数据均以均数±标准差（±s）表示，符合正态分布的计量资料组间比较采用单因素方差分析，方差齐时两两比较采用LSD法分析，方差不齐的资料采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组体质量变化比较 分组给药前，与正常组比较，模型组和各给药组大鼠体质量较轻，差异有统计学意义（P＜0.01），但各给药组与模型组大鼠体质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；给药 21 d时，模型组及各给药组大鼠体质量低于正常组，差异有统计学意义（P＜0.01），各给药组与模型组大鼠体质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；从体质量增长情况来看，正常组大鼠体质量增长较模型组和各给药组明显，差异有统计学意义（P＜0.01），但模型组大鼠体质量增长较各给药组缓慢，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 各组对大鼠体质量变化的影响（±s，g）

表1 各组对大鼠体质量变化的影响（±s，g）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

n 给药前 给药21 d 体质量增长10 387.90±30.49 443.70±35.30 55.80±13.84 10 319.40±32.62**348.60±36.01**29.20±7.76**桂枝白芍 10 320.67±35.98**360.61±42.56**39.94±8.85**##桂枝赤芍 10 324.40±28.94**363.85±37.10**39.45±8.75**##桂枝当归 9 319.22±26.38**359.39±34.29**40.17±6.91**##桂枝熟地 10 317.25±30.77**358.75±34.37**41.50±8.00**##甲氨喋呤 10 329.50±40.92**373.80±49.38**44.30±12.92**##组别正常模型

2.2 各组大鼠AI比较 同正常组比较，模型组大鼠AI评分均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，给药前及给药7、14 d时各药物组大鼠AI评分差异均无统计学意义（P＞0.05）；给药21 d时，各给药组大鼠AI评分均低于模型组，其中桂枝白芍、桂枝赤芍、桂枝当归及甲氨喋呤组明显低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。各给药组组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组CIA大鼠AI评分比较（±s，分）

表2 各组CIA大鼠AI评分比较（±s，分）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05。

n 给药前 给药21 d 10 0.00±0.00 0.00±0.00 10 5.90±2.42** 7.00±2.16**桂枝白芍 10 6.11±2.26 4.56±2.51#桂枝赤芍 10 5.80±2.35 4.40±2.17#桂枝当归 9 5.78±2.82 4.56±2.55#桂枝熟地 10 5.80±2.53 4.70±2.45甲氨喋呤 10 5.70±2.83 4.50±2.55#组别正常模型给药7 d 0.00±0.00 6.20±2.20**6.22±2.39 5.80±2.53 5.89±2.89 6.10±3.11 5.90±3.07给药14 d 0.00±0.00 7.10±2.33**5.67±2.29 4.90±2.08 5.22±3.03 5.90±3.07 5.50±3.03

2.3 各组大鼠后爪容积比较 在给药前及给药7、14、21 d，模型组大鼠后爪容积均大于正常组，差异有统计学意义（P＜0.01）；给药前各药物组大鼠后爪容积与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；给药7、14 d时，各药物组大鼠后爪容积较模型组有不同程度下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）；给药21d时，各药物组大鼠后爪容积较模型组明显下降（P＜0.05）。见表3。

表3 各组CIA大鼠后爪容积比较（±s，mL）

表3 各组CIA大鼠后爪容积比较（±s，mL）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05。

n 给药前 给药21 d 10 1.97±0.06 2.20±0.08 10 2.99±0.80** 3.04±0.55**桂枝白芍 10 3.04±0.71 2.55±0.43#桂枝赤芍 10 2.96±0.59 2.57±0.37#桂枝当归 9 2.94±0.85 2.54±0.45#桂枝熟地 10 2.92±0.74 2.48±0.34#甲氨喋呤 10 2.91±0.81 2.57±0.43#组别正常模型给药7 d 2.06±0.07 3.00±0.75**3.02±0.57 2.86±0.62 2.92±0.81 2.86±0.68 2.79±0.72给药14 d 2.13±0.07 3.06±0.61**2.78±0.56 2.73±0.50 2.75±0.65 2.58±0.41 2.67±0.56

2.4 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平较正常组明显升高（P＜0.05或 P＜0.01）；与模型组比较，各药物组大鼠血清TNF-α、IL-6水平明显降低（P＜0.05或P＜0.01）；各给药组大鼠血清 TNF-α、IL-1β、IL-6 水平组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较（±s，pg/mL）

表4 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较（±s，pg/mL）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

n TNF-α IL-1β IL-6 10 10.10±2.30 15.76±2.51 35.94±22.47 10 15.13±1.81** 19.87±3.06* 114.03±40.30**桂枝白芍 10 12.43±2.28# 18.81±4.01 57.54±14.61##桂枝赤芍 10 11.00±2.57## 19.39±4.48 59.48±29.41##桂枝当归 9 12.54±2.93# 19.45±2.78 48.21±17.85##桂枝熟地 10 11.04±1.90## 17.27±4.01 39.61±12.47##甲氨喋呤 10 11.60±2.53## 18.19±3.86 49.48±18.65##组别正常模型

2.5 各组大鼠关节病理变化情况 正常组大鼠关节组织结构清楚完整，关节软骨表面规则光华，软骨细胞呈椭圆形，排列整齐；模型组可见关节滑膜细胞大量增生，大量炎症细胞浸润，以淋巴细胞为主，关节软骨及骨组织破坏，增生的纤维组织向骨髓腔内侵入生长；桂枝白芍、桂枝赤芍、桂枝当归、桂枝熟地组可见少量成纤维样滑膜细胞增生，关节面粗糙不规则，可见骨质破坏，炎症细胞浸润；甲氨喋呤组大鼠滑膜组织轻中度增生，软骨细胞排列不整齐，关节软骨层变薄，关节面粗糙，骨质破坏，有淋巴细胞和中性粒细胞浸润。见图1。

图1 各组大鼠关节病理变化HE染色（×200）

3 讨论

类风湿关节炎是一种慢性以侵蚀性关节炎为主要特征的常见自身免疫病，其主要病理表现为滑膜炎、血管翳形成，逐渐出现关节软骨和骨破坏，最终导致关节畸形和功能丧失[10]。虽然RA病因复杂，发病机制尚不完全明确，但促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6在驱动RA关节滑膜炎症反应和关节破坏起关键的作用[11-13]。TNF-α、IL-1β 均可以激活 NF-κB通路，诱导血管血管细胞黏附因子（VCAM-1）、内皮生长因子（VEGF）等多种细胞因子生成，促进RA滑膜炎症和血管翳的形成[14-15]。TNF-α和IL-1β通过上调核因子κB受体活化因子配体（RANKL）表达，促进破骨细胞生成，介导RA骨破坏[16-17]。IL-6主要是参与成纤维细胞的激活和增殖、破骨细胞分化等，可通过JAK/STAT3和WNT通路促进OC分化和抑制OB生成，导致RA骨破坏[18-19]。

RA属于中医“痹症”“历节风”“尪痹”等范畴。张仲景《金匮要略·中风历节病脉证并治》提出：“荣气不通，卫不独行，荣卫慎微，三焦无所御，四属断绝，身体羸瘦，独足肿大，黄汗出，胫冷。假令发热，便为历节也。”《类证治裁·痹证》载：“诸痹……良由营卫先虚，腠理不密，风、寒、湿乘虚内袭，正气为内所阻，不能宣行，因而留滞，气血凝涩，久而成痹。”《医林绳墨》曰：“大率痹由气血虚弱、荣卫不能和通，致令三气乘于腠理之间。”可见营卫失和在痹证的发病中至关重要。现代医家国医大师徐经世认为气血不足、营卫失调是尪痹发生的重要内部原因[20]；姜泉教授认为尪痹之起，一则邪气乘体虚侵入，二则营卫之气不和[21]；马文辉教授认为营卫倾移是类风湿关节炎的核心机制之一[22]。总之“营卫气血失和”是RA发病的重要原因，在临床中使用频率较高前3味中药有当归、桂枝、白芍[23-25]，桂枝白芍、桂枝当归配伍是较常用的配伍，也从侧面证实了“调和营卫气血”治疗的重要性，特别是RA的早期。

桂枝味辛、甘，性温，具有发汗解肌、温通经脉、助阳化气之功。《本草纲目》曰：“桂枝透营达卫，故能解肌而风邪去，脾主营，肺主卫，甘走脾，辛走肺也。”《本草分经》谓：“桂枝温经通脉，发汗解肌，调和营卫。”桂枝辛温发散走表而入卫分，入卫则温卫，甘温走脾能通达血脉而入营分，入营则和营，故有调和营卫、温通经脉之功。芍药苦酸甘、微寒，归肝脾二经，具有养血凉血，敛阴和营止痛的功效；与桂枝相合，一营一卫，一收一散，起到调和营卫、散风敛营和解肌发表之功。当归甘、辛、温，归肝、心、脾经，其味甘而重，善于补血，其气轻而辛，又能行血，补中有动，行中有补，为补血行血之要药，具有养血活血、通补兼备、补虚祛瘀之功效；与桂枝配伍，温中有补，补中有行，温通行血，使血虚瘀滞，血得濡养，瘀滞得行，寒凝得温则通，起到温经通络、调和气血之功。熟地甘、微温，归肝、肾经，甘温质润，善滋补肾阴益精以生血，为滋阴养血补虚之要药；与桂枝配伍，一阴一阳，一血一气，温润宣通经脉，起到调和气血阴阳、温通养血之功。

本研究中桂枝与白芍、桂枝与赤芍、桂枝与当归、桂枝与熟地配伍具有调和营卫气血之功，对风寒湿环境刺激CIA模型大鼠体重增长和关节炎指数不同程度改善；桂枝调和营卫气血配伍组合能明显减轻CIA大鼠后足容积，抑制CIA大鼠血清炎性细胞因子TNF-α、IL-6的表达，发挥抗炎及减轻骨破坏，但其具体分子机制尚需进一步研究。