太原市冬季PM2.5对人源巨噬细胞U937毒性作用的研究

袁婉珺，魏海英，耿红

（山西大学 环境与资源学院，山西 太原030006）

0 引言

PM2.5是一种常见的空气污染物，可通过鼻腔和嘴部吸入并深入肺部，沉积在气道和肺泡中，之后还可能进入循环系统以引起肺和外部组织的反应[1-3]，造成呼吸系统（急性支气管炎，急性上呼吸道和呼吸道感染等）和心血管（心肌梗死，动脉粥样硬化等）疾病。根据世界卫生组织（WHO）的数据，2016年全球城市和农村地区的空气污染估计每年导致420万人死亡。PM2.5的化学成分多达数千种以上，可分为有机和无机两大类[4]，有机成分中多环芳烃（PAHs）作为优先控制的有毒有害污染物，具有致癌、致畸、致突变性等毒性，且在环境中广泛分布[5]。

芳香烃受体（AhR）是一种配体依赖性胞内受体，能够参与环境毒素、致癌物和化学物的代谢，感应调节生物节律变化，氧化应激等[6]。AhR因此也成为控制许多生理过程的关键转录因子，包括细胞的增殖、凋亡、分化、黏附和迁移，参与调节自身免疫、感染和癌症的免疫应答。AhR为研究遗传和外界环境因素对健康和疾病免疫应答等生理过程的影响提供了一个模型信号通路，其可介导有毒的环境化学物质如PAHs、2，3，7，8-四氯二苯并-p二恶英（TCDD）或多氯联苯（PCB）产生许多反应，从而使AhR在介导炎性反应和维持机体正常发育与生理功能中发挥着重要作用[7]。多项体外实验表明，PM2.5的有机提取物暴露能够引起炎性因子如环氧霉素-2（COX-2）、白介素-8（IL-8）、白介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等的mRNA表达上调，从而诱导细胞产生炎症[8-9]。Vogel等人研究发现，城市扬尘或柴油尾气中颗粒物的有机提取物诱导了IL-8、COX-2和CYP1A1的高表达，这些基因被认为参与了PM介导的巨噬细胞炎症反应[10]。

关于PM2.5对巨噬细胞的研究，我们前期的研究主要集中于动物模型的肺泡巨噬细胞，并且表明苯并[b]荧蒽、菲的暴露对大鼠肺泡巨噬细胞造成显著的细胞毒性[11-12]，但是PM2.5对人体细胞巨噬细胞的毒性机制，特别是PM2.5吸附的PAHs与细胞毒性反应的相关性尚不清晰，因此在本研究中采集太原市冬季PM2.5，分析其PAHs含量，并使用HepG2细胞模型检测PM2.5是否可以激活芳香烃受体，之后将巨噬细胞U937暴露于太原市冬季PM2.5有机物提取液，分析了CYP1A1和炎症细胞因子COX-2，IL-8、IL-1β和TNF-αmRNA的表达情况，以阐明PM2.5对人源巨噬细胞毒性的具体机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

人源肝癌HepG2细胞和单核系U937细胞株均购于美国ATCC公司；荧光素酶报告系统检测试剂盒和PTX.DIR质粒购于Promega公司；RNA提取试剂盒来自Zymo research公司；反转录试剂盒和SYBR Green核酸染料来自Applied Biosystems公司；实时荧光定量PCR基因引物来自美国IDT公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素、葡萄糖、丙酮酸钠、佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯（TPA）、二甲基亚砜（DMSO）、苯并[a]芘（B[a]P）均购于美国Thermo Fisher Scientific公司.

1.2 PM2.5收集和提取

采样点位于山西大学环境与资源学院五层楼顶（N37°47′，E112°34′），距离地面约15 m，采用大流量采样器（Thermo Anderson），流量为1.13 m3/min，配以3 μm孔径的石英微孔过滤器（Whatman）来收集PM2.5。在采集前，将过滤器在450°C的条件下加热24 h以去除内毒素，并称量滤膜在采集前的重量。样品采集于2015年12月15日到12月21日，每次采样24 h后取下滤膜并称重，计算颗粒物重量，收集时间持续7 d。随后将滤膜剪成碎片，置于装有超纯水（Milli-Q）的锥形瓶中，超声1 h，提取液经0.2 μm微孔滤膜过滤（大约100 mL），冷冻干燥得到粉末，置于-80°C备用。在使用之前，将提取的PM2.5溶于二甲基亚砜（DMSO；0.1%）中，以制备最终浓度为 10 μg/μL的 PM2.5悬浮液。

1.3 PM2.5中 PAHs的测定

16种PAHs的测定按照（GB-HJ 646-2013）中规定的方法使用索氏提取法提取滤膜上的样品，使用GC-MS对各PAHs进行测定。16种PAHs的GC-MS分析条件如下表1所示。

表1 GC-MS测定16种PAHs的分析条件Table 1 Analysis conditions of measuring 16 kinds of PAHs

1.4 荧光素酶的表达与检测

前期研究表明，AhR能够被PM2.5吸附的某些PAHs激活并在细胞中表达[13-14]。为了检测太原冬季PM2.5是否可以激活AhR。本研究使用了人源肝癌HepG2细胞，因为其具有很高的转染效率，细胞内可以检测到很高的AhR蛋白含量，为检测各种配体激活AhR提供了有效的载体[15-16]。将HepG2细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基的12孔细胞板中，细胞密度在 2×105和 2×106细胞 /孔之间。使用PTX.DIR（插入含有单纯疱疹病毒胸苷激酶（TK）启动子和荧光素酶报告基因的载体中，与CYP1A1转录起始位点相关的XRE序列5’-CTCCGGTCCT TCTCACGCAA CGCCTGGGCA-3’从核苷酸-1026延伸至-999）稳定转染细胞。实验设有对照组（DMSO；0.1%），PM2.5组（10 μg/mL），和阳性对照组（B[a]P；10 μg/mL），对转染后的HepG2细胞进行染毒，每组设置平行4个，37°C下培养4 h。使用荧光素酶检测系统及荧光分光光度计进行测定，数据以相对光单位（RLU）表示。

1.5 人体巨噬细胞U937培养与染毒处理

为了检测太原冬季PM2.5暴露不同时间引起的巨噬细胞毒性反应，将人源单核U937细胞置于12孔细胞板，含有10%胎牛血清，100 U青霉素和100 μg/mL链霉素补充4.5 g/L葡萄糖，1 mmol/L丙酮酸钠和10 mmol/L HEPES的RPMI 1640培养基中。细胞密度在2×105和2×106细胞/孔之间。为了诱导其分化为巨噬细胞，将U937细胞用佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯（TPA；5 μg/mL）处理，并在37 °C含有5% CO2的组织培养箱中培养48 h。实验设计分组同1.4，在37°C下分别培养：6 h，24 h和48 h。

1.6 RNA提取逆转录及实时荧光定量PCR

U937巨噬细胞暴露于PM2.56 h，24 h和48 h后，使用RNA提取试剂盒提取U937巨噬细胞中RNA，使用cDNA反转录试剂盒将RNA转化cDNA。PCR的反应体积为20μL，按每管10 μL SYBR，8.2 mL ddH2O、0.4 μL 正向引物、0.4 μL 反向引物、1 μL cDNA模板加样，采用IQ5实时定量PCR仪扩增。反应条件为94℃变性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，均扩增45个循环，将cDNA按1倍、3倍、9倍、27倍稀释作标准曲线，采用IQ5软件将所测结果与β-actin基因的结果作比值来确定目的基因的表达量。实验中所使用的引物序列见表2。

表2 qPCR引物序列Table 2 Primer sequences for qPCR analysis

1.7 统计分析

使用Graphpad Prism 8.0软件用于数据统计学分析，数据表示为平均值±标准误差（SEM）。使用单因素方差分析（one-wayANOVA）和Tukey检验用于确定不同处理组之间的统计学显著性差异，当P＜0.05时被认定为其具有显著性差异。

2 实验结果

2.1 PM2.5中PAHs的含量分析

表3为太原冬季PM2.5中PAHs浓度，由表可知，PAHs的总浓度为70.38 ng/m3，占到PM2.5总量的0.91%。在16种优先控制PAHs的中，茚并[1，2，3-cd]芘、苊烯、萘的含量较低，芘、荧蒽、䓛、苯并[b]荧蒽、苯并[a]芘、二苯并[a，h]蒽、苯并[g，h，i]苝7种含量较高，尤其是苯并[b]荧蒽在所测有机物中浓度最高为13.66 ng/m3。由图1可以看出，芘、荧蒽、䓛、苯并[b]荧蒽、苯并[a]芘、二苯并[a，h]蒽、苯并[g，h，i]苝这7种化合物含量约占到了16种PAHs含量的72%。

表3 太原冬季PM2.5中PAHs的浓度Table 3 Concentrations of PAHs of wintertime PM2.5 extract from Taiyuan

图1 太原市冬季PM2.5中不同多环芳烃（PAHs）百分比Fig.1 Percentage of different PAHs in wintertime PM2.5 extract from Taiyuan

2.2 太原市冬季PM2.5在HepG2细胞中激活AhR的表达

PAHs能够结合AhR并诱导一系列的靶向基因的表达从而产生毒性反应[17]。为了检测太原PM2.5中的PAHs能否诱导AhR表达，将10 μg/mL的PM2.5和B[a]P暴露于稳定转染HepG2细胞，检测荧光素酶的活性，结果见图2。与对照组（DMSO）相比，太原冬季PM2.5和阳性对照（B[a]P）均诱导荧光素酶活性显著增强，分别为对照组的52和44倍（P＜0.01），表明PM2.5激活了HepG2细胞中的AhR。

图2 太原冬季PM2.5对HepG2细胞荧光素酶活性的影响（与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，n=4）Fig.2 Effects of Taiyuan wintertime PM2.5extracton luciferase activity in HepG2 cells.（*P＜0.05，**P＜0.01 versus control，n=4）

2.3 太原冬季PM2.5在U937巨噬细胞中对CYP1A1表达的影响

很多研究将CYP1A1的表达量作为确定化合物激活AhR的依据[18]。为了进一步证实PM2.5激活了AhR，本研究测定了CYP1A1mRNA的表达（图3），在染毒 6 h，24 h和 48 h后，PM2.5组CYP1A1mRNA的表达与对照组（DMSO）相比，均显著上调（P＜0.05）。在染毒24 h，与对照组相比PM2.5诱导CYP1A1的表达增加了36倍（P＜0.01）。

图3 太原冬季PM2.5在U937巨噬细胞中对CYP1A1mRNA表达的影响（与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，n=4）Fig.3 Effects of wintertime PM2.5extract from Taiyuan on the expression ofCYP1A1mRNAin U937 macrophages（*P＜0.05，**P＜0.01versus control，n=4）

2.4 太原冬季PM2.5在U937巨噬细胞中对COX-2，IL-8，IL-1β和TNF-αmRNA表达的影响

为了证明PM2.5激活AhR后能够进一步引起了细胞炎性反应，本研究测定了炎性细胞因子COX-2，IL-8，IL-1β和TNF-αmRNA的表达情况（图4）。PM2.5在U937巨噬细胞中诱导了各炎性因子mRNA的高表达，与对照组相比，均具有统计学上的显著差异（P＜0.05）。在不同的染毒时间6 h，24 h和48 h，4种细胞因子mRNA表达水平与对照组相比具有显著差异（P＜0.05），在染毒24 h达到峰值（P＜0.01），尤其是COX-2和IL-8，其相比于对照组分别增加了4.8和5倍。

图4 太原市冬季PM2.5在U937巨噬细胞中对COX-2，IL-8，IL-1β和TNF-αmRNA表达的影响Fig.4 Effects of wintertime PM2.5extract from Taiyuan on the expression ofCOX-2，IL-8，IL-1βand TNF-αmRNAin U937 macrophages（*P＜0.05，**P＜0.01versus control，n=4）

3 讨论

太原市以煤炭为主要能源，长期以来以冶金、机械、化工、煤炭为支柱产业，是以输出能源、原材料、矿山机械产品为主的全国重要能源重化工城市。煤炭燃烧、工业排放等产生的污染物容易吸附于PM2.5表面，使得PM2.5含有很多包括PAHs在内的有机化合物[19]。PAHs种类繁多，其中包括苯并[a]芘、苯并[g，h，i]苝、苯并[b]荧蒽等在内的16种PAHs对人体健康影响最大。本研究中太原冬季PM2.5中 PAHs的含量为 70.38 ng/m3，其中苯并[b]荧蒽为16种PAHs中含量最高为13.66 ng/m3，苯并[a]芘的浓度为5.013 ng/m3，这几种化合物的浓度都远超于《环境空气质量标准》（GB 3095-2012）（2.5 ng/m3）[20]。此外芘、荧蒽、䓛、二苯并[a，h]蒽、苯并[g，h，i]苝在PM2.5中的浓度也较高，PM2.5的有机组成部分尤其是PAHs通过一系列的细胞毒性反应对人体各组织造成急性和慢性毒性[21]。

已有研究已经证实，PAHs是PM2.5诱导激活AhR的主要因素[17，22]。AhR作为一种细胞溶质受体蛋白，可以结合各种配体，依据结合时间，暴露途径和细胞因子环境的不同会不同程度地影响机体免疫系统[23]。正常情况下，AhR在细胞中处于不活跃的状态，但是与PA H s结合后，使A h R与芳香烃受体蛋白（ARNT）缔合组成异源二聚体，AhR-ARNT复合物与特定的脱氧核糖核酸（DNA）识别位点二恶英反应元件（DRE）特异性结合可诱导一系列靶基因的转录，细胞色素P450家族基因CYP1转录活动[24]。本研究的结果也证实了这一反应机理，在PTX.DIR转染的HepG2细胞中，太原冬季PM2.5诱导了荧光素酶活性的增强，表明AhR被激活。需要说明的是，本研究在荧光酶素测定中使用的是人体HepG2细胞，这是因为HepG2细胞有更高的转染效率[15]，并且在我们前期进行的预实验中，使用PTX.DIR转染U937和HepG2细胞，结果发现U937细胞的转染效率远低于HepG2，并且在荧光素酶测试中AhR在HepG2细胞中的表达量大约是U937细胞的20倍。使用U937巨噬细胞是因为本研究主要侧重于颗粒物对人体巨噬细胞的毒性反应，有文献表明人源巨噬细胞U937和THP1在检测空气PM2.5所表达的炎性反应比较显著[8，16]，所以我们选取了二者进行了预实验，在进行qPCR检测之后发现炎性因子在U937细胞中表达的更好。虽然HepG2和U937是两种不同的人体细胞，但仍可为进一步说明太原市冬季PM2.5中的PAHs激活了AhR提供有力依据。

CYP1A1是一种主要的肝外细胞CYP酶，其将多种外源性和内源性化合物（包括PAHs）催化代谢成致癌衍生物的能力已被广泛研究[25]。CYP1A1是AhR转录调控的基因，是参与PAH代谢和清除的关键酶。作为体内一种重要的代谢酶，CYP1A1除了诱导突变，还在感染及炎症反应过程中起着重要作用[26]。已有研究证实，在感染或炎症产生时，机体中不同细胞及器官中的CYP1A1表达存在差异，导致内源性和外源性化合物的代谢发生变化，从而在宿主中发挥保护或损害等不同作用[27]。已有很多研究证实CYP1A1的芳香烃受体（AhR）依赖性调控机制，本研究在人体巨噬细胞U937中，染毒24 h后PM2.5诱导AhR介导的基因CYP1A1mRNA表达显著上调，进一步证明了太原冬季PM2.5激活了AhR。

AhR也可以协同性地诱导炎症信号通路中的COX-2或白介素类细胞因子表达导致炎症的产生[28]。COX-2是调节细胞生长，分化和凋亡的重要酶，它的高表达与细胞恶性转化诱导炎症密切相关[29-30]，而IL-1β，IL-8和TNF-α都是被认为与 PM2.5介导的炎性反应的重要标志物。本研究中太原冬季PM2.5诱导了炎症因子COX-2、IL-1β、IL-8和TNF-α在人体U937巨噬细胞中的表达，从而诱导了细胞的炎性反应。

综上所述，太原市冬季PM2.5中的PAHs激活了AhR并且促进了巨噬细胞炎性反应，说明AhR在PM2.5诱导的炎症反应中起重要的调控作用，但具体的机制仍需进一步研究。