大白菜细菌性角斑病抗性鉴定方法的建立

任峻辉 刘 焱 吉晶晶 陈志强 张耀伟

（东北农业大学园艺园林学院，黑龙江哈尔滨 150030）

大白菜细菌性角斑病是猝发性病害，对大白菜的产量及品质影响较大。近年来该病害不仅发生得愈加频繁而且发病地域越来越广泛，华北、东北地区发生普遍，山东、河南、四川等地也均有发生，抗细菌性角斑病已成为大白菜育种的重要方向。抗病育种需要有抗病种质资源，简单有效的接种鉴定方法是鉴定资源抗病性的前提，也是抗病育种的基础。大白菜细菌性角斑病发现近60 年，发病呈上升趋势，但至今还未见关于大白菜抗细菌性角斑病鉴定方法的报道。细菌性角斑病的病原菌为丁香假单孢菌（Pseudomonas syringae），能侵染多种蔬菜作物（Bull et al.，2004，2015；Harighi，2007；Takikawa &Takahashi，2014；Nay et al.，2019）。生产中黄瓜细菌性角斑病发病相对较重，较早地建立了黄瓜细菌性角斑病的抗性鉴定方法（关钟燕，1990；马柏壮 等，2013）。本试验研究了不同接种温度、接种湿度、接种苗龄以及接种浓度对大白菜苗期细菌性角斑病发病的影响，以期建立大白菜细菌性角斑病的抗性鉴定方法，为大白菜抗细菌性角斑病种质资源筛选以及抗病育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大白菜细菌性角斑病病样于2018 年8 月采自哈尔滨市向阳乡东北农业大学实验实习基地大白菜育种谱地，供试大白菜为东北农业大学园艺学院选育的自交系A224-1（感病）、264-1-1（感病）、203-1（耐病）及331-1（抗病）。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌性角斑病病原菌分离 取发病株叶片，用清水冲洗干净，在无菌环境下切取病健交界处5 mm × 5 mm 的小块，浸入70%乙醇中消毒3～4 s，再用无菌水反复清洗4～5 次，每次清洗3 min；然后用灭菌玻璃棒将表面消毒后的病叶组织研碎，并加入少量无菌水稀释，用涂布棒蘸取菌液均匀涂在KB 固体培养基上，放入28 ℃恒温培养箱内进行培养；待单菌落出现，挑取单菌落于KB 液体培养基中扩繁菌株，备用（张吉光 等，2010）。

1.2.2 病原菌分子鉴定 采用16S rDNA 通用引物1492R（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′）/27F（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）、gyrB基因引物UP-1E（5′-TGTAAAACGACGGCCAGTGCNG GRTCYTTYTCYTGRCA-3′）/APrU（5′-CAGGAAA CAGCTATGACCAYGSNGGNGGNAARTTYRA-3′）和rpoD基因引物70R（5′-ACGACTGACCCGGT ACGCATGTAYATGMGNGARATGGGNACNGT-3′）/70F（5′-ACGACTGACCCGGTACGCATGTAYA TGMGNGARATGGGNACNGT-3′）对菌株进行PCR扩增（Yamamoto et al.，2000），扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，对单一、清晰的亮带进行胶回收。将胶回收产物与Buffer 按4V∶1V混合，按上述步骤再进行凝胶电泳，回收产物送华大基因科技股份有限公司进行测序，测序结果与NCBI 进行比对、鉴定。

1.2.3 大白菜细菌性角斑病抗性鉴定方法 采用三因素三水平正交试验设计，按L9（34）正交表（表1）设置9 个处理（表2），分析接种苗龄、湿度及温度对大白菜细菌性角斑病发病的影响。以喷接无菌KB 液体培养基作为对照，每处理20 株，3次重复。

表1 L9（34）正交试验因素水平表

将大白菜自交系A224-1 分3 期播种于7 cm ×7 cm 的营养钵中，每期间隔5 d；每钵播3 粒，拉十字期留1 株；置于日光温室内，昼/夜温度控制在25～28 ℃/15～18 ℃，待幼苗分别长至3～4 叶期、5～6 叶期、7～8 叶期进行接种试验。为达到最佳接种条件，接种试验在人工气候室中进行。病原菌菌株用KB 液体培养基扩繁，采用分光光度计法测定细菌悬浮液浓度并稀释到1 × 108cfu·mL-1；采取喷接方式，每株选1 片幼叶进行接种并做好标记，每株接种量1.5～2.0 mL，接种后保湿48 h。于接种7 d 后调查发病情况。

得到最佳接种苗龄、接种湿度及接种温度后，将供试菌株配制成3 个不同浓度菌液：1 × 108、1 × 1010、1 × 1012cfu·mL-1，分别接种于不同抗性的3 个大白菜自交系264-1-1、331-1 和203-1 上，保湿24 h。分别于接种后7、10 d 调查发病情况，从而确定最佳接种浓度。

1.2.4 病情分级与发病情况调查 采用Image J 软件测量发病的叶片面积和病斑面积，以病斑面积与叶片面积的比率划分病情等级：0 级，不发病；1级，病斑面积＜20%；3 级，20%≤病斑面积＜40%；5 级，40% ≤病斑面积＜60%；7 级，60%≤病斑面积＜80%；9 级，病斑面积≥80%。

群体分级标准参照“九五”国家攻关组制定的病毒病和霜霉病的群体分级标准。免疫（I）：病情指数为0；高抗（HR）：0 ＜病情指数≤11.11；抗病（R）：11.11 ＜病情指数≤33.33；耐病（T）：33.33 ＜病情指数≤55.55；感病（S）：55.55 ＜病情指数≤77.77；高感（HS）：77.77 ＜病情指数≤100.00。

1.3 数据处理

将病情指数进行平方根转换后，采用DPS 9.50数据处理系统进行方差分析和差异多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 大白菜细菌性角斑病病原菌分离、鉴定

取田间发病株（图1）进行病原菌分离、纯化，获得ALP-1 菌株。该菌株在KB 固体培养基的表面上菌落显现为乳白色，扁平、近圆形或略呈不规则形；单菌落的直径为5～7 mm，中央凸起且具同心环纹；边缘呈透明状。菌体短杆状，极生鞭毛。病原菌经16S rDNA、gyrB和rpoD基因扩增、测序，与NCBI 网站比对后鉴定为丁香假单孢菌Pseudomonas syringaepv.syringaevan Hall。按照柯赫氏法则，将ALP-1 菌株接种于大白菜自交系A224-1 上，发病症状与田间症状一致；取接种后病斑进行病原菌再分离、鉴定，鉴定病原与接种的菌株ALP-1 完全一致。确定采自哈尔滨市向阳乡东北农业大学实验实习基地的大白菜细菌性角斑病病原菌为丁香假单孢菌丁香致病型（Pseudomonas syringaepv.syringaevan Hall）。

2.2 接种苗龄、湿度及温度对大白菜细菌性角斑病发病的影响

2.2.1 不同处理的发病情况 从表2 可以看出，大白菜细菌性角斑病发病率和病情指数最高的均是处理3，处理2 次之。参照“九五”国家攻关组制定的大白菜病毒病和霜霉病的群体分级标准和其他病害抗性鉴定等级划分标准（马燕勤 等，2018；孙叶烁 等，2019），处理2 的病情指数为30.06，属于抗病等级。而2018 年自交系A224-1 田间发病重于其他育种材料，同时7～8 叶期大白菜接种3 d后开始发病，明显早于3～4 叶期和5～6 叶期。综合各方面因素考虑，处理3（苗龄7～8 叶期、接种温度25～30 ℃、接种湿度90%～100%）为大白菜细菌性角斑病发病的最佳条件组合。

表2 试验设计及极差分析结果

2.2.2 病情指数极差分析 为了分析接种苗龄、接种温度、接种湿度对大白菜细菌性角斑病发病的影响程度，对这3 个因素进行极差分析。由表2 可以看出，接种温度的极差最大，其次为接种湿度，接种苗龄的极差最小。表明苗期抗性鉴定受接种温度的影响最大，接种湿度影响次之，接种苗龄对其影响最小，且最佳优化条件为A3B3C3。

2.2.3 病情指数方差分析 进一步的方差分析结果表明（表3），C 因素和B 因素的F值均大于F0.01=6.23，说明这两个因素各水平间差异达极显著水平，二者对细菌性角斑病发病的影响均较大；A 因素F值小于F0.05=3.93，不同苗龄间差异不显著。方差分析结果与极差分析的结果基本保持一致。

表3 大白菜细菌性角斑病病情指数方差分析结果

2.3 不同接种浓度对大白菜细菌性角斑病发病的影响

确定大白菜细菌性角斑病发病的最优条件组合后，选取田间有抗感差异的3 个大白菜自交系264-1-1、203-1、331-1 进行最佳接种浓度筛选。从表4 可以看出，当菌液浓度达到1 × 1010cfu ·mL-1时，接种10 d 后3 个自交系的病情指数分别为33.21、40.27、57.95，分别表现为抗病、耐病、感病；1 × 108cfu·mL-1和1 × 1012cfu·mL-1浓度菌液接种10 d 以及3 个浓度菌液接种7 d，3 个自交系之间抗感差异区分度欠佳。所以最佳接种浓度为1 × 1010cfu·mL-1，应在接种后10 d 进行调查。

表4 不同接种浓度对大白菜细菌性角斑病发病的影响

3 结论与讨论

大白菜细菌性角斑病的最适发病温度为25～28 ℃（张淑霞 等，2006），本试验设计了3 个接种温度：15～20 ℃、20～25 ℃和25～30 ℃，为了更接近于自然环境将昼夜温差设置为5 ℃。试验结果表明温度因素对细菌性角斑病发病影响较大，15～20 ℃不利于发病，25～30 ℃发病较重，说明高温有利于细菌性角斑病发病。本试验接种后发现湿度越大发病越明显，在接种湿度为90%～100%的条件下最易发病，这一结论与张淑霞等（2006）阴雨天易发病且病菌会借风雨和灌溉水等方式进行传播的研究结果相符。本试验确定适宜的接种温度为25～30 ℃、接种湿度为90%～100%，符合细菌性角斑病田间发病规律和发病基本条件，笔者多年田间观察发现大白菜细菌性角斑病多在8 月上中旬、大雨过后空气潮湿的时候大面积发生，而且发病程度更为严重。

目前，关于大白菜细菌性角斑病接种的最适苗龄未见报道。据田间发病调查统计结果，大白菜进入莲座期且遇阴雨天气时易发病，而且多在大白菜外叶发生，严重时病斑会相互连片。本试验结果表明，接种苗龄对发病的影响与接种温度和接种湿度相比属于次要因素，但是不同接种苗龄仍然对大白菜细菌性角斑病发病产生影响，7～8 叶期接种更容易发病。说明大白菜细菌性角斑病在大苗龄植株上更易发病，这也与田间观察结果相符。

尽管到目前为止，还未见大白菜细菌性角斑病抗性鉴定方法方面的报道，但是接种浓度对蔬菜作物抗病性鉴定结果的影响应该是很大的，浓度过低植株不易发病，而浓度过高会导致耐病品种和抗病品种发病程度偏重，不易于区分不同品种间的抗性差异。本试验结果表明，接种浓度对大白菜细菌性角斑病发病的影响较大，菌液浓度为1 × 1010cfu ·mL-1时，接种10 d 后可以区分不同品种间的抗、感病差异，因此确定该浓度为大白菜苗期活体接种的最佳浓度。

本试验仅是对大白菜细菌性角斑病抗性鉴定方法的初次探讨，希望能对我国大白菜抗细菌性角斑病育种提供借鉴。