单宁酸对青海田鼠食物摄入量与小肠结构的影响

钟 亮，余义博，朱红娟，曲家鹏

（1. 中国科学院西北高原生物研究所，青海 西宁 810008；2. 中国科学院大学，北京 100049；3. 青海省动物生态基因组学重点实验室，青海 西宁 810008）

食物选择是指动物对其栖息地中的食物种类做出选择的行为，与动物自身生理状态及环境中食物的可利用量密切相关[1]。影响食物选择的因素主要包括：1)食物中营养成分含量[1]；2)动物的自身消化道结构、集群类型及大小、性别、生理状况等[2]；3)植物资源的季节性、地理位置分布以及生态环境的变化[3]；4)食物的气味和味道[4]；5)植物次生代谢产物[5]。

食草动物和植物的采食-反采食协同进化形成了相互协调、相互制约的适应关系[1,6]。在长期进化过程中，植物对食草动物形成了防御系统，即物理和化学防御[7-8]，使动物的取食和消化代谢受到阻碍，从而让动物在食物选择上受到一定限制[1]。物理防御主要是利用植物自身的结构，比如针、刺、棘等，使食草动物不易获取其茎叶、果实等；而化学防御主要是指植物包含的次生代谢产物等抑制动物的食物摄入量、生长发育等[8-9]。

植物次生代谢产物是植物与环境在长期协同进化过程中形成的[10]，根据化学结构的不同，次生代谢产物可分为酚类、萜类和含氮有机物等[11]。单宁酸是最常见的植物次生代谢产物之一，广泛存在于植物中[11]。单宁酸味涩，能够减少食草动物对植物的取食量[12]。单宁酸还能够影响动物的形态、生理及行为等，取食较多的次生代谢产物后，动物会产生恶心呕吐感[13]。单宁酸可与动物消化道内的蛋白质或酶结合形成络合物，降低消化酶的活性，使肠道微生物菌群失调，降低动物对营养物质的吸收[14-15]。单宁酸到达单胃动物的下胃肠道时，还可能改变肠上皮细胞的功能状态，导致营养吸收和利用受损[16]。

小肠是动物消化吸收功能的基础，其结构对营养物质的吸收有重要作用。动物的营养状况反过来也影响小肠形态结构和功能，特别是小肠的绒毛长度(villus length, V)、隐窝深度(crypt depth, C)、肠粘膜厚度以及绒毛表面积等[17-18]。小肠绒毛长度与细胞数量显著相关，绒毛短时，成熟细胞少，小肠对营养成分吸收能力差；隐窝深度反映了细胞生成率，隐窝变浅，细胞成熟率升高，分泌功能加强。小肠绒毛长度/隐窝深度(V/C)与小肠的功能状态相关，比值下降，表明小肠消化吸收功能减弱；比值升高，则小肠消化吸收功能增强，生长加快[19]。李茜和侯海锋[20]的研究表明，单宁酸可影响小肠形态，使肉鸡空肠的绒毛变长，隐窝深度下降，V/C 比值增大。

鼠类对含有单宁酸的食物具有一定的选择能力[21]。在野外环境下，啮齿动物会更喜食单宁酸含量高的食物[22]，但也有研究发现，有些鼠类会更喜食单宁酸含量低的食物。如对东方田鼠(Microtus fortis)以及棕色田鼠(Lasiopodomys mandarinus)喂食含有不同浓度单宁酸的食物，两种动物都会优先选择进食单宁酸含量低的食物[23-24]，因此不同啮齿动物对含不同浓度单宁酸食物的选择可能存在差异。

植物群落丰富度越高，动物的食物谱越广，除了选择取食含较低单宁酸的植物，还能够通过摄入含不同次生代谢产物的植物来减少单宁酸对其的影响[25]。随着海拔升高，草甸植物群落多样性降低[26]，食草动物对食物的可选择性降低。同时，在高寒草甸生态系统中，多种植物单宁酸浓度随着海拔升高而增加[27]。因此本研究选择生活在高海拔地区的青海田鼠(Lasiopodomys fuscus)来探究单宁酸对其体重的影响以及青海田鼠对单宁酸的适应性。

青海田鼠是仓鼠科(Circetidae)田鼠属动物，主要分布在青海、四川等地，栖息在海拔3 700～4 800 m的高寒草甸和草原[28]。通常青海田鼠很少取食含有较高单宁酸等次生代谢产物的植物[29]，但在食物匮乏的情况下，青海田鼠会摄食含高单宁酸的植物[30]。为探讨高原小哺乳动物对单宁酸(TA)的适应机制，本研究以青海田鼠为研究对象，制备不同TA 含量的饲料，分析单宁酸对鼠类的体重和肠道结构的影响，为探讨单宁酸在高原动植物相互关系中的作用提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验动物

2017 年8 月，在果洛州玛沁县青珍乡(34°12′05′ N，100°05′16′′ E，海拔4 326 m)高寒草甸采用笼捕法捕获24 只健康、成年雄性青海田鼠。带回实验室后，单笼饲养于中国科学院西北高原生物研究所动物 饲养房内的450 mm × 289 mm × 180 mm 塑料笼内，适应7 d，笼内铺有木屑，提供足量的水和食物。

1.2 试验食物

将北京科澳协力饲料有限公司生产的大小鼠生长全价颗粒饲料粉碎后，分别添加0、3%、6%含量的单宁酸(购自上海迈瑞尔化学技术有限公司)[29]，再使用饲料颗粒机加工成颗粒状饲料，放置于低温干燥处。

1.3 饲喂试验

2019 年8 月25 日至10 月25 日，参考李俊年等[31]以及张宾[32]的方法，将体重相似的青海田鼠随机分成3 组，每组8 只，分别用0 (对照组，CK)、3%和6%TA 处理的饲料连续喂食。在饲喂期间保持室内温度保持在(20 ± 3) ℃，定期清理粪便和垫料，避免交叉污染。分别在第7 天、第14 天、第28 天、第48 天和第60 天称量青海田鼠的食物摄入量和体重变化。

采用Robbins[33]的公式计算试验个体对TA 食物的摄入量，即：

食物摄入量 = 投入食物量 − 剩余食物量。

1.4 样品处理

在试验第61 天将所有青海田鼠麻醉处死，取十二指肠、空肠、回肠中段的3～4 cm 肠管，迅速放置于10%中性福尔马林溶液中固定，用于制作组织切片，测定小肠绒毛长度和隐窝深度。

1.5 测定指标

取下的肠道组织固定48 h 后，经过水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋处理后，进行切片，经苏木精-伊红(HE)染色，在显微镜下观察小肠结构，使用Motic Med 6.0 图像软件拍照，在视野下测量5 个最长肠绒毛处的绒毛长度和隐窝深度。

1.6 统计分析

采用混合线性效应模型分析单宁酸对青海田鼠体重变化或食物摄入量的影响，以处理前到处理后(0 − 60 d)青海田鼠的体重或食物摄入量作为响应变量，单宁酸的浓度和时间作为固定效应，个体差异作为随机效应(随机截距)。模型分析的目标：1)响应变量随时间的变化有无显著差异；2)响应变量随时间的变化在各组有无显著差异。模型选择的依据是响应变量体重与时间的变化趋势：若响应变量与时间的变化趋势是直线型，则时间变量设为连续性变量；若响应变量与时间的变化趋势是无规律型，则时间变量设为分类型变量。将单宁酸的浓度0、3%和6%设为x1、x2和x3，响应变量为y；进食后若时间为连续型变量，将第 0 − 60天表示为 t；若时间为分类型变量，将第 0、7、14、28、48、60 天分别表示为t1、t2、t3、t4、t5、t6。

根据以上假设，参考赵晋芳的研究[34]，构建7 个模型，分别为：

式中：模型Ⅰ为空模型；模型Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ中的时间参数为连续型数据；模型Ⅳ、Ⅶ中的时间参数为分类型数据。

将模型Ⅰ至模型Ⅶ进行比较，使用对数似然比评估模型，通过AIC 信息准则进行模型选择，根据ΔAIC 值进行排序，筛选出最优模型[34-35]。

采用单因素方差分析探讨单宁酸对小肠绒毛长度和隐窝深度的影响。使用R 3.4.3 中的lmer 程序包进行混合线性模型分析和模型选择，使用emmeans程序包进行单个时间点的组间比较。

2 结果

2.1 模型选择

模型选择结果(表1)表明，单宁酸对青海田鼠体重的影响选择模型Ⅶ；单宁酸对青海田鼠食物摄入量的影响选择模型Ⅶ。

2.2 单宁酸对青海田鼠体重变化的影响

混合线性效应模型结果表明 (表2)，在单宁酸作用下，青海田鼠的体重随着时间有显著变化 (F =2.235，P = 0.015)，并且各组青海田鼠的体重随着时间变化也有显著差异 (F = 62.943，P ＜ 0.001)。试验开始时，各组间体重无显著差异 (P ＞ 0.05)；第7 天时，3% TA 处 理 组 的 体 重 显 著 高 于 对 照 组 (P ＜0.05)，6% TA 处理组的青海田鼠的体重与对照组无显著差异，表明刚开始时6% TA 对青海田鼠体重增加无抑制作用，3% TA 对体重增加产生促进作用；第14 天和第42 天时，3 组青海田鼠体重接近；第60 天时，6% TA 处理组的体重显著高于对照组，表明青海田鼠对6% TA 在一段时间之后产生了适应性，6% TA 对其体重增加具有促进作用。

2.3 单宁酸对青海田鼠食物摄入量的影响

混合线性效应模型结果表明(表3)，在0、3%和6% TA 的处理下，青海田鼠的食物摄入量随着时间有显著变化(F = 5.949，P ＜ 0.001)；各组青海田鼠的食物摄入量，随着时间的变化也有显著差异(F =8.726，P = 0.003 67)。第7 天时，3% TA 处理组和对照组的青海田鼠食物摄入量分别下降了33.3%和24.2%，6% TA 处理组上升了63.6%，对照组与3% TA 处理组的食物摄入量差异显著(P ＜ 0.05)，表明刚开始进食时，3% TA 对青海田鼠的食物摄入产生抑制作用；第14 天时，对照组与6% TA 处理组的青海田鼠的食物摄入量上升，3% TA 处理组的食物摄入量下降，3 个处理组间食物摄入量无显著差异 (P ＞ 0.05)，但在第14 天之后，3%和6% TA 处理组的青海田鼠食物摄入量呈上升趋势；第28 天至第60 天，3%处理组食物摄入量显著高于对照组，表明在第14 天后青海田鼠对3% TA 产生适应性，TA 促进青海田鼠食物摄入量增加。

表1 混合线性效应模型选择结果Table 1 Mixed linear effect model selection results

表2 单宁酸对青海田鼠体重变化的影响Table 2 Effects of tannic acid (TA) on body weight of Lasiopodomys fuscus g

表3 单宁酸对青海田鼠食物摄入量的影响Table 3 Effects of tannic acid (TA) on food intake of Lasiopodomys fuscus g

2.4 单宁酸对青海田鼠小肠绒毛和隐窝深度的影响

不同TA 处理组青海田鼠小肠绒毛长度有明显差异(表4)。6% TA 处理组青海田鼠的小肠绒毛长度显著长于对照组和3% TA 处理组(P ＜ 0.05)，3% TA处理组青海田鼠的小肠绒毛亦显著长于对照组(P ＜0.05)，表明TA 对青海田鼠小肠绒毛生长具有促进作用。对照组的隐窝深度显著低于3% TA 和 6%TA 处理组(P ＜ 0.001)，3% TA 处理组的隐窝深度与6% TA 处理组无显著差异，表明TA 在一定程度上促进青海田鼠小肠隐窝深度的生长。绒毛长度/隐窝深度比(V/C)在3 组处理组中无显著差异 (P ＞ 0.05)。

3 讨论与结论

3.1 单宁酸与青海田鼠食物摄入量

动物体重变化与其能量代谢状况密切相关。体重的维持和调节取决于能量摄入和消耗之间的平衡。混合线性效应模型结果表明，随着青海田鼠对单宁酸的适应，高浓度的单宁酸对青海田鼠的体重由抑制转变为促进作用，这与单宁酸对大林姬鼠(Apodemus speciosus)作用相似[36]。但如表2 所列，尽管不同处理组青海田鼠体重有显著差异，但总体上青海田鼠体重是增加的。何岚等[37]研究表明，含3%和6%单宁酸的饲料可显著抑制东方田鼠体重增长，与本研究结果相反。

啮齿动物的食性既受自身的遗传性影响，也受生存环境的影响，是自然选择和环境适应的结果。顾新州[38]对高原鼠兔食物选择的研究结果显示，生活在高海拔地区高原鼠兔的食物选择会随着栖息环境的变化，产生食性泛化。食性泛化是啮齿动物对环境适应的结果，也是其能从不同植物中获取更多营养所采取的策略。高海拔地区植被稀少，青海田鼠食物匮乏，对食物的选择性更低[39]，虽然TA 对青海田鼠的体重有一定的负作用，但在能量需求条件下，为适应严酷环境，青海田鼠会做出改变食物选择性和食物可利用率的决策。通过摄食的调节来协调消化、同化水平的变化，补偿能量和营养的需求，使得青海田鼠能取食含较高浓度TA 的植物。

表4 单宁酸对青海田鼠绒毛长度和隐窝深度的影响Table 4 Effects of tannic acid (TA) on the villus length and crypt depth of Lasiopodomys fuscus

单宁类植物次生代谢产物对动物的影响因其活性对动物的生理状况[16]、植物群落丰富度而不同[26]，动物的食物选择对单宁酸的适应性亦有所不同[25]。试验前期，TA 对青海田鼠食物摄入量具有一定的抑制作用，随着时间的推移，抑制作用逐渐消失；试验后期，青海田鼠适应了高浓度TA，TA 对青海田鼠食物摄入量增加起到促进作用。李俊年等[31]对根田鼠食物摄入量的研究显示，在3%和6%单宁酸处理下，TA 对根田鼠食物摄入量产生抑制作用。单宁酸可通过与胃肠道内的酶类结合，抑制酶类的功能，进而降低动物的食物摄入量[40]。TA 对青海田鼠食物摄入量的抑制作用下降，可能是由于青海田鼠对TA 的抑制作用产生了适应性[31]，同时TA 与唾液蛋白结合[41-42]，其中的脯氨酸能够降低TA 的作用[43]。高浓度TA 能够促进青海田鼠食物摄入量的增加，可能主要有两个原因。一是，植物次生代谢产物可分为两大类：有毒代谢产物和消耗减少代谢产物，前者导致食物摄入和排便减少，食物消化率增加；后者导致食物摄入和排便增加，食物消化率不变[44]。二是，植物产生的次生代谢产物对取食后的食草动物并不完全是负面作用的[45]。植物产生次生代谢产物不只是由于食草动物的取食，还可能是受到紫外线、强光、低温、病原体入侵等因素诱导产生[46]。生长在青藏高原的植物，长期处于极端胁迫的环境中(如高海拔、低温、强紫外线辐射等)，其酚类次生代谢物浓度较高[27]，青海田鼠适量采食含单宁酸的食物，有助于清除体内的超氧化合物，避免其对细胞的损伤。Lin 等[30]研究也认为，高原鼢鼠挖掘等活动需要大量的能量，只能采食更多含有单宁酸的植物来满足自身能量的需求。

3.2 单宁酸与动物小肠结构

小肠的发育情况决定了肠道内营养物消化吸收，小肠消化吸收功能受到肠绒毛、隐窝深度与黏膜厚度和绒毛表面积等的影响。小肠绒毛长度与小肠吸收功能相关，其长度影响动物的生长发育[47]。试验结果显示，单宁酸可以促进青海田鼠小肠绒毛的生长。Bozinovic 等[48]研究也证实南美洲栗鼠(Chinchilla brevicaudata)通过促进小肠的增长，来适应添加的TA。小肠隐窝深度与上皮细胞生成率有关[49]。当外界或动物体内因素引起小肠上皮细胞生成率上升、隐窝深度变深，小肠会产生大量具有分泌功能的上皮细胞，引起动物的腹泻[50]。本研究中TA 组小肠隐窝深度显著高于对照组，表明TA 可加快小肠上皮细胞生长速率，增加隐窝深度。TA 到达动物肠道后可能改变肠上皮细胞的功能状态，导致小肠营养吸收和利用受损[16]。食物添加缩合单宁酸也会导致大鼠肠粘液分泌过多和肠上皮细胞增殖增加[51]。动物小肠的吸收功能还和绒毛长度与隐窝深度的比值(V/C)有关[50]。V/C 值增加表明小肠吸收消化能力增强；反之亦然。从结果来看，3 个处理组的V/C 值无显著差异，说明TA 并没有通过改变小肠结构影响其消化吸收能力。陈宝江等[52]研究提出，TA 对不同动物的影响存在显著差别。苟昌勇等[53]的研究认为，TA 可通过增加肠道胰蛋白酶活性增强仔猪养分消化吸收。此外TA 还可以降低小肠食糜pH、增加养分溶解度，提高营养物质的吸收[54-55]。TA 对青海田鼠的促生长作用机制尚不清楚，可能是通过影响消化酶、肠道微生物等方式来实现。

综上，本研究讨论了单宁酸对青海田鼠食物摄入量与小肠结构的影响，研究结果表明，单宁酸会抑制青海田鼠进食，随着时间推移，抑制作用降低，青海田鼠对单宁酸产生适应性后，单宁酸起到促进其进食的作用，但这一促进作用并不是通过改变小肠结构而实现的。