脂联素基因多态性与子宫内膜异位症的相关性*

张华文，杨 立，任琛琛，张 峰，李飞燕，陆 杰，杨 靖，乔明静

(郑州大学第三附属医院妇产科，郑州 450052)

子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)是一种常见的妇科疾病,组织学上表现为子宫内膜基质和腺体在子宫外生长,发病率在育龄期妇女中约占5%～10%,在不孕妇女中可达50%，在慢性盆腔痛妇女中为50%～60%[1,2]。EMs的发生与多种遗传和环境因素有关,该疾病的遗传度可达50%[3]。脂联素(adiponectin，ADIPOQ)是最丰富的血浆脂肪因子,主要来源于白色脂肪组织。最初ADIPOQ被认为是重要的脂质代谢和能量消耗的调节剂,但是越来越多的证据表明ADIPOQ可通过影响巨噬细胞极化及激活JAK/STAT3信号并激活AMPK通路发挥抑制血管生成、抗炎和促凋亡的作用[4]。已有研究发现，EMs患者血清及腹腔液中脂联素表达降低,但目前尚无脂联素单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)与EMs的相关报道。本文采用飞行时间质谱分析法对河南地区汉族女性ADIPOQ基因多态性与EMs发病相关性进行初步探讨。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2018年3月至2019年12月在郑州大学第三附属医院住院且经腹腔镜及病理确诊的内异症患者282例,根据美国生育学会分类(1985年)进行分期。选择同期因输卵管积水、卵巢单纯性囊肿、畸胎瘤行腹腔镜检查或腹腔镜手术,排除EMs及子宫腺肌病的271例患者为对照组。两组均为无血缘关系的河南籍汉族育龄期妇女,且均在原籍稳定居住3代以上,均无内异症家族遗传史及其他遗传病,排除其他内外科及内分泌疾病,3个月内无服用激素类药物及抗代谢类药物史。EMs组与对照组的年龄[(34.15±5.8)岁 vs (33.13±5.5)岁]、BMI[(23.8±2.8)kg/m2vs (24.0±2.9)kg/m2]比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究患者均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 提取基因组DNA 采集外周静脉血2mL,EDTA抗凝,使用全血基因组DNA提取试剂盒(Sangon Biotech公司,中国上海)提取基因组DNA。用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific公司,美国)检测DNA纯度,确保A260和A280比值为1.8～2.0,经1.25%琼脂糖凝胶电泳仪进行质检合格,置于-20℃储存备用。

1.2.2 基因SNP位点的选择 基于gnomAD数据(https://macarthurlab.org/2018/10/17/gnomad-v2-1/)和以前文献报道,优先选择已证实功能相关的SNP并保证在东亚人口中最小等位基因频率(minimum allele frequency,MAF)>0.01。

1.2.3 引物设计合成 结合文献并采用Assay Design 3.1软件(Agena公司,美国)设计PCR引物和单碱基延伸引物(均由北京博淼生物技术有限公司合成),PCR引物序列见表1。

表1 4个SNP位点的PCR扩增引物序列

1.2.4 PCR扩增 每个反应总体积5μL,水1.85μL,10×PCR缓冲液0.625μL(含15mmol/L MgCl2),MgCl2(25mmol/L)0.325μL,dNTP(25mmol/L each,Agena公司,美国)0.1μL,HotStar Taq (5U/μL,Agena公司,美国)0.1μL,每条扩增引物(500mmol/L each,Agena公司,美国)1.0μL,DNA样本(20ng/μL)1μL。反应条件:94℃ 5min;94℃ 20s,56℃ 30s,72℃ 1min,45个循环；72℃ 3min；冷却至4℃。加2μL虾碱性磷酸酶(SAP)去除体系中多余的dNTP,反应体系7μL,其中PCR产物5μL,10×SAP缓冲液(New England Biolabs公司,美国)0.17μL,SAP酶(1U/μL)0.30μL,水1.53μL,反应条件：37℃ 20min；85℃ 5min；4℃。

1.2.5 单碱基延伸 总反应体积9μL,包含PCR纯化产物7μL,水0.619μL,10×iPLEX缓冲液0.2μL,终止混合物0.2μL,延伸引物0.940μL,iPLEX酶(Ge Healthcare公司,美国)0.041μL,再次进行PCR反应。PCR反应条件:94℃ 30s；94℃ 5s；52℃ 5s,80℃ 5s内部5个循环,持续外部40个循环；72℃ 3min,冷却至4℃。反应结束后每份延伸反应产物均加入6mg阳离子交换树脂(Ge Healthcare公司,美国)脱盐纯化。

1.2.6 芯片点样及质谱检测 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术通过将分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空管经激光激发，不同荷质比的核酸分子在电场中飞行时间不同，通过检测到达检测器的时间获得分析物的分子量，特点是具有极高的精确度和灵敏度，适用于低量样本检测。使用MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪(Agena公司,美国),将纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP芯片(Agena公司,美国)上,使用MassARRAY Analyzer 4.0质谱仪(Agena公司,美国)检测,运行MassARRAY TYPER 4.0软件(Agena公司,美国),根据质谱峰图得出SNP分型数据。位点检出率大于99%，随机选择10%的标本进行重复基因分型检测,得出重复样品的一致性率大于98%。

1.3 统计学分析 运用SPSS22.0软件双侧t检验比较病例组与对照组年龄、BMI的差异。采用χ2检验评估对照组中基因型频率是否偏离了Hardy-Weinberg平衡(HWE)；使用非条件logistic回归模型计算了比值比(odds ratios,ORs)及95%置信区间(confidence intervals,CIs)对ADIPOQ基因多态性和EMs风险之间的关系进行了评估；将EMs患者按临床分期、CA125水平、有无痛经或有无不孕史进行分层分析；以上均利用PLINK 1.90软件完成。使用Haploview 4.1软件评估各位点间的连锁不平衡(LD)及单倍体型频率,双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SNP连锁不平衡分析 将r2>0.80视为强连锁不平衡,软件计算结果显示,rs822395、rs17366568、rs2241766和rs1501299四个位点间不存在强连锁现象，见图1。

图1 ADIPOQ基因中四个位点的连锁不平衡分析

2.2 ADIPOQ基因SNP位点在EMs组和对照组中的多态性分布 各SNP位点的基因型分布均符合HWE(P>0.05)，表明研究对象具有群体代表性。ADIPOQ rs2241766位点GG基因型与EMs发生风险降低相关,经年龄和BMI校正后,其致EMs效应是TT基因型的0.71倍(P=0.040,OR=0.71,95%CI=0.51～0.98)。校正年龄和BMI后,rs2241766的加性模型(P=0.014,OR=0.71,95%CI=0.55～0.93)和显性模型(P=0.026,OR=0.68,95%CI=0.48～0.95)均与EMs有关。这进一步表明rs2241766位点的突变型等位基因G可能为EMs的保护因素,且这种保护作用随着等位基因G的数目增加而有增加的趋势。rs1501299基因型分布频率在两组间亦有一定的差异(加性模型:校正后P=0.050,OR=0.75,95%CI=0.57～1.00),提示rs1501299位点的T突变可能为EMs发生的保护因素,而其他两个位点rs822395和rs17366568未观察到与EMs的关联性(P>0.05)，见表2。

表2 ADIPOQ基因型多态性和EMs危险关系的logistic回归模型分析[n(%)]

*P<0.05为差异有统计学意义

2.3 ADIPOQ基因SNP位点在EMs患者中的分层分析 经年龄和BMI校正后,rs2241766位点GT+GG基因型与TT基因型EMs患者相比高CA125水平、痛经发生风险降低(P=0.003,OR=0.40,95%CI=0.21～0.73和P=0.023,OR=0.55,95%CI=0.32～0.93),同样III～IV期EMs患者更多为rs2241766 TT基因型携带者(P=0.026),有不孕史EMs患者与无不孕史者比携带TT基因型频率更高(56.0 vs 48.4%),但差异无统计学意义(P=0.091)。可见rs2241766位点的等位基因G突变可能为EMs患者高CA125水平、痛经甚至是不孕的保护因素。rs1501299位点携带T等位基因的(GT+TT)基因型为EMs患者高CA125水平、不孕发生的保护因素(P=0.020,OR=0.49,95%CI=0.27～0.89和P=0.039,OR=0.60,95%CI=0.37～0.97),rs1501299位点的GG基因型在III～IV期EMs患者中频率更高,但差异无统计学意义(P=0.080)。rs822395和rs17366568位点基因型频率亦与EMs临床分期、CA125水平、有无痛经、有无不孕史无关(P>0.05)。见表3。

表3 ADIPOQ基因型与EMs易感性的分层分析[n(%)]

续表3

3 讨 论

ADIPOQ基因由16kb碱基组成,包含3个外显子及2个内含子,与编码胶原VIII、胶原X、TNF和补体因子C1q的基因同源。脂联素与其特殊受体(AdipoR1、AdipoR2和T-钙黏蛋白)结合,并通过AMPK、mTOR、NF-κB、STAT3和JNK等多种途径启动激活多个细胞内信号传导,在调节激素水平、炎症反应、血管生成、细胞增殖与凋亡和纤维化等过程中均发挥重要作用。

有研究表明,EMs患者的血清脂联素水平降低,晚期EMs患者腹膜液中脂联素水平显著降低,而循环血浆脂联素水平很大一部分(30%～70%)受遗传学的影响。本研究选择了与癌症或炎症风险相关的4个SNP进行了分析。先前研究表明，rs2241766位点携带G等位基因可增加循环血浆中脂联素水平，并降低乳腺癌风险[5]。此外，Cui等[6]研究中，对于接受手术切除的非小细胞肺癌患者,rs2241766 TT+GT基因型携带者的总生存率低于GG基因型携带者。推测rs2241766的G突变发挥抑癌作用可能与ADIPOQ分泌增加，从而抑制新生血管生成和促进细胞凋亡等有关。本研究发现，rs2241766位点的纯和突变GG基因型在EMs患者中频率明显降低，提示ADIPOQ基因突变可能影响异位内膜的侵袭与种植。rs2241766位于外显子2可导致同义的Gly15Gly变化,且与位于ADIPOQ 3'-UTR的rs2082940、rs4686803位点具有强连锁关系，靶基因3'-UTR的遗传变异可能影响miRNA的结合和miRNA的稳定性。因此,该位点的G突变可能影响剪接并修饰基因的表达,提高ADIPOQ mRNA及ADIPOQ水平，进而诱导AMPK磷酸化及调控其下游通路在EMs的发展中发挥保护作用，但该假设需在细胞和动物模型中进行进一步测试。

另一个在ADIPOQ研究中经常被基因分型的SNP是rs1501299，rs1501299位于内含子2,与调控ADIPOQ mRNA和蛋白质表达水平的表达数量性状基因座(expression quantitative trait Loci，eQTL)相关，最近的meta分析推测rs1501299与ADIPOQ基因尚未识别的3'非翻译区(UTR)的功能变异区存在连锁不平衡,并且该内含子中可能包括顺式作用RNA元件、内含子剪接增强子和内含子剪接沉默子等功能元件而发挥基因表达的调控作用。本研究发现rs1501299位点的T突变可能为EMs发生保护因素,之前并无该因子与EMs相关报道。Kaklamani等[5]研究证实，rs1501299 GT或GG基因型与脂联素水平降低及乳腺癌风险增加有关。一项meta分析显示，无论哪种癌症类型,rs1501299T等位基因均与总体癌症风险降低相关[7],考虑到EMs具有恶性疾病特质，本实验与之前癌症方面的研究结论并不冲突。

rs17366568位于内含子1,最近一项全基因组关联研究发现其与欧洲人血浆脂联素水平有较强关联,据推测位于rs17366568两侧的3个SNP均会影响转录位点结合位点[8]。而本研究未发现该位点与EMs的易感性相关,可能与rs17366568位点在本研究人群中A等位基因突变频率明显较低有关(本研究人群MAF=0.02,欧洲人口MAF=0.125),也说明了中国河南人群和欧洲白人的ADIPOQ存在遗传异质性。

本研究发现，ADIPOQ的rs2241766、rs1501299位点变异与痛经的发生相关。继发性痛经是EMs的典型表现，既往报道表明痛经是由于子宫内膜细胞异位着床引起的局部炎症反应引起的。这种反应导致炎症因子的释放，促进子宫收缩，随后引发痛经。Xuan等[9]发现,脂联素可通过调节JmjC家族组蛋白去甲基化酶3(JMJD3)，促进巨噬细胞极化和阻止巨噬细胞浸润而进行免疫调节，减少人巨噬细胞中的促炎细胞因子,如IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α，而在子宫内膜发挥抗炎作用。研究报道，IL-1β与痛经的疼痛作用有关，IL-8与痛经的严重程度和子宫内膜基质细胞的增殖有关[10]。所以，遗传突变、转录调控因子、各种炎症因子在EMs及其相关痛经的发生中可能具有相互协调的作用。

本研究还发现,ADIPOQ的rs1501299位点突变与EMs相关不孕的发生相关。EMs可引起盆腔粘连和输卵管阻塞，从而导致不孕。卵母细胞受损也被认为是EMs相关不孕的可能机制。研究表明，脂联素可通过经典的MAPK途径对人、小鼠、山羊和猪的卵母细胞的减数分裂和初始胚胎发育成熟发挥积极作用[11-12]，并且脂联素可通过抑炎作用维持子宫内膜的稳定[13]。Kim等也发现ADIPOQ可能以自分泌/旁分泌/内分泌方式在影响植入前胚胎发育和子宫容受性中起重要作用[14]，可见脂联素与妇女不孕的发生密切相关，而ADIPOQ的基因位点突变与EMs相关不孕的具体作用机制有待进一步探究。

ADIPOQ的SNP位点可能成为EMs发生发展的预测指标，并且可评估并监测EMs不孕患者的生育能力或作为其选择体外受精(in vitro fertilization，IVF)的参考指标，也有可能成为EMs痛经和不孕治疗的潜在靶点。本研究的局限是未检测ADIPOQ基因多态性是否改变了蛋白表达水平,将来需明确脂联素位点突变、脂联素水平和EMs发生的具体关系,根据结论建议相关女性进行生活方式干预(饮食和体育锻炼)或适当服用药物(噻唑烷二酮/二甲双胍/非诺贝特)以调节脂联素水平,做到一级预防。此外,研究的样本量相对较小及不能排除基因-基因和(或)基因-环境相互作用的影响也是本研究的局限之处。

综上所述,ADIPOQ基因多态性可能与EMs发生、临床分期、CA125水平、痛经及不孕相关,对EMs诊断及预防具有一定指导作用,后续需进行大样本、多中心、多基因及联系环境因素进行研究,进一步解释EMs的发病机制。