IMSI和ICSI来源胚胎PGT-A结局的回顾性研究

史艳彬,蒋树艳,邵小光

(大连市妇女儿童医疗中心 生殖与遗传医学中心，大连 116000)

辅助生殖技术治疗男性因素不育或常规体外受精失败时所使用的卵胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)技术最理想的情况是选择支持高受精率和胚胎良好发育的精子细胞，即成熟、有活力、高DNA完整性和结构健全[1]。在ICSI中，常规的精子选择是基于低倍镜(光学放大倍率为200～400倍)下的运动性和大体形态[2]。2002年，Bartoov等[3]提出的运动精子细胞器形态学检查(motile sperm organelle morphology examination，MSOME)是一种无创性的检测活动精子的方法，其使用大于6000倍的微分干涉对比(differential interference contrast，DIC)光学系统，可获得更好的精子头部三维视图，进而行胞浆内形态选择精子注射(intracytoplasmic morphologically selected sperm injection,IMSI)[4]，其选择标准包括精子的顶体、染色体后板、颈部、线粒体、尾部和细胞核等六种亚细胞器。通过分析精子微小形态学指标对精子进行选择是辅助生殖技术的又一个挑战。有研究认为，IMSI是一种新的技术，增加了治疗成本，且没有任何有效的证据证明其有效性和安全性[5]。因此，鉴别个体化精子亚细胞形态是否必要，精子形态与染色体完整性的关系一直是业界研究的热点问题。本研究在染色体水平研究精子形态对胚胎发育的影响，进而探讨IMSI在辅助生殖领域的有效性和安全性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2016年5月至2017年5月于大连市妇女儿童医疗中心生殖门诊就诊并接受植入前遗传学检测的83个周期患者，按其受精方式随机分为IMSI组(n=48)和ICSI组(n=35)，IMSI组、ICSI组分别成功活检囊胚144个和98个。入组条件：年龄≥38岁；双方染色体无异常；仅男性因素不孕或合并输卵管因素；至少2个四级囊胚(4CC除外)；移植日子宫内膜≥7mm；患者充分知情同意。排除条件：合并子宫内膜异位症、卵巢子宫内膜异位症、子宫肌瘤、子宫腺肌症、宫腔粘连、子宫内膜息肉、卵巢早衰、子宫畸形、生殖道感染、不明原因不孕等疾病的患者；女方内分泌检查异常，如甲状腺功能异常、黄体功能异常、多囊卵巢综合征(polycystics ovary syndrome，PCOS)、高泌乳素血症(prolactinemia，PRL)、糖尿病等；女方全身性疾病，如TORCH阳性、严重感染高热疾病、慢性消耗性疾病、重度贫血或心力衰竭、肝肾疾病、高血压疾病等；女方免疫学检查异常；女方吸烟、酗酒、吸毒。

1.2 超促排卵方案及取卵 患者采用长方案或拮抗剂方案。长方案：患者于月经第3天开始口服炔雌醇环丙孕酮片，1片/d，共21d(拜耳医药)。口服炔雌醇环丙孕酮片第16天加用短效曲普瑞林(德国辉凌)0.1mg/d，达到降调标准：子宫内膜厚度<5mm；卵泡生成激素(FSH)<5IU/L、黄体生成激素(LH)<5IU/L、雌二醇(E2)<30ng/L。卵泡直径4～7mm后开始用重组人促卵泡激素(默克Serono公司)启动。拮抗剂方案：月经第3天用重组人促卵泡激素(默克Serono公司)启动，主导卵泡直径达12mm时加用思则凯(默克Serono公司)0.25mg/d至HCG日。通过超声技术和外周血雌二醇水平监测卵泡生长情况，至少有2个以上主导卵泡直径达18mm时注射人绒毛膜促性腺激素(HCG，中国丽珠)刺激卵泡最终成熟，36h后经阴道B超引导下取卵。卵冠丘复合物孵育4～6h后剥除颗粒细胞，待行IMSI或ICSI。

1.3 精液优化 患者丈夫禁欲2～5天，取自慰后的新鲜精液样本，收集于无菌容器，37℃培养箱液化30min。精液液化后经非连续密度梯度离心法(美国SAGE，ART-2024)300g力离心12～15min，上游处理优化精液，待用。

1.4 精子形态分析及挑选 应用LeicaDIC显微镜(AM6000)，使用浸镜油在100×物镜下实时对活动精子进行形态分析。正常形态精子表现为细胞光滑、对称、椭圆形，并具有正常的顶体、精子头部、颈部、尾部及线粒体，同时精子头部无明显细胞质液滴或细胞浆存在。对头部有空泡的精子拍照并测量空泡直径。A级精子：不含空泡；B级精子：含有1～2个小空泡(空泡直径<1μm)；C级精子：含有2个以上小空泡；D级精子：含有1个及以上的大空泡(空泡直径≥1μm)(图1)。选取A和B级，且尾部中段形态均正常的精子按常规ICSI流程进行注射。所有精子分析由同一操作人员完成。

图1 精子头部形态(Leica 100×油镜，DIC，NA 1.30)

1.5 囊胚培养、活检及细胞二代测序 正常受精卵放至G1-PLUS和G2-PLUS培养液(瑞典，Vitrolif)中培养至四级囊胚(4CC除外)，激光活检5～10个囊胚滋养层细胞，利用植入前胚胎染色体非整倍体检测试剂盒(北京贝瑞何康生物技术有限公司)进行全基因组扩增后进行二代测序。活检后的囊胚冷冻。

1.6 胚胎移植及妊娠结局 第一周期依据胚胎形态学解冻一枚囊胚进行移植，并揭盲患者PGT-A结果；此后移植周期依据PGT-A结果。移植后第14天测定血清β-HCG浓度监测妊娠，移植后4～6周阴道B超下出现孕囊和胎心确定临床妊娠。妊娠12周行无创产前筛查(noninvasive prenatal testing，NIPT),妊娠17周行羊水胎儿脱落细胞核型分析。

2 结 果

2.1 一般临床资料 IMSI组和ICSI组患者的年龄、不孕年限、不孕类型、ART次数、基础内分泌、窦卵泡数比较，差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 IMSI组和ICSI组患者的一般临床资料比较

2.2 实验室情况比较 IMSI组和ICSI组患者的精液参数(平均精液体积、精子密度、精子活率、MSOME法评估的A+B级精子细胞比例)、平均获卵数、MII卵数、2PN数、受精率、卵裂率及囊胚形成率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；IMSI组的优胚率显著高于ICSI组(P<0.05)(表2)。

表2 IMSI组和ICSI组患者实验室情况比较

2.3 PGT-A结果与妊娠结局比较 IMSI组的胚胎非整倍体率低于ICSI组，临床妊娠率高于ICSI组，妊娠组非整倍体率低于ICSI组，早期流产率低于ICSI组，活产率低于ICSI组，新生儿体重高于ICSI组，男婴率低于ICSI组，出生后1min Apgar评分高于ICSI组，但差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 IMSI组和ICSI组患者PGT-A结果与妊娠结局比较

3 讨 论

ICSI时评估单条精子的形态与受精、胚胎质量、妊娠结局有很好的相关性[6]。IMSI技术可对活动精子进行实时的亚细胞水平的形态分析，检测到胚胎学家认为形态“正常”的活动精子中的小细胞器畸形，既弥补了常规ICSI在精子形态学筛选中的不足，也避免了一些传统精子质量评估方法无法与ICSI同时进行的问题[7]。有研究结果提示，在IMSI中，正常细胞比例越低，妊娠率越高。这一明显矛盾的一个解释是，MSOME中正常细胞百分比较低的患者需在超放大镜下进行更广泛的搜索，以找到最高质量的精子细胞；而正常细胞比例较高的患者因有足够的正常精子受精，因此他们不能从广泛的研究中获益[8]。本研究通过比较男性因素不孕患者IMSI和ICSI来源胚胎的实验室和临床结局，以探讨IMSI技术是否有益。

IMSI中选择无空泡精子能否提高受精率、卵裂率及囊胚形成率，尚无定论[9-11]。多项研究表明，精子头部空泡与精子DNA的异常染色质包装密切相关[12]。与无空泡精子相比，有空泡精子的精子DNA和染色体的完整性受到损害[13]。在ICSI中使用携带空泡的异常精子时，胚胎的非整倍体或精子中的DNA损伤会导致胚胎发育的延迟[14]。因此，在理论上，使用IMSI可使男性不育和胚胎发育不良的不育夫妇获得遗传正常胚胎发育和临床结果的几率更高。本研究中IMSI组的优胚率显著高于ICSI组，提示有空泡的精子对胚胎的早期发育有一定影响；两组的2PN受精率、卵裂率及囊胚形成率无显著差异(P>0.05)。原因可能是本研究样本量较小，且两组MSOME法评估的A+B级精子差异无统计学意义。

本研究结果显示，IMSI组胚胎的非整倍体率低于ICSI组，临床妊娠率高于ICSI组，早期流产率低于ICSI组，但差异无统计学意义(P>0.05)。可能是因ICSI组患者的精子细胞空泡数量和面积较小，这部分精子的染色体或DNA损伤较小，胚胎有能力对其进行修复。本研究为回顾性设计，样本量过小，本研究结果有待进一步验证，精子头部空泡的实质及其对妊娠结局的影响有待进一步研究。

目前，没有证据表明IMSI会增加先天性畸形[15-18]。本研究结果显示，IMSI与ICSI的活产率无显著差异。可能原因为，与ICSI相比，IMSI技术更耗时，可能由于暴露时间增加而激发了配子中的氧化应激机制[19-20]。后续研究中应不断优化IMSI技术，并将配子的氧化应激源降至最低。本研究ICSI组中，揭盲前移植了1枚PGT-A非整倍体胚胎(chr16:1-903547531)，但NIPT和羊水胎儿脱落细胞核型检查结果提示均正常，最后正常活产，推测这枚胚胎可能是嵌合体胚胎，且嵌合细胞数比例较小。

综上所述，精子形态评价在辅助生殖领域的重要性日益受到重视。在显微受精技术中，选择高质量的活动精子对提高胚胎质量至关重要，但使用哪种技术进行最佳精子选择，目前仍有争议。本结果未提示IMSI可改善助孕结局。IMSI技术的优化及受益人群的选择可能是未来研究的一个方向。