碘佛醇可逆性影响大鼠血脑屏障通透性的形态学机制

王何莹，坚雅婷，赵莉莉，李 涛，张益恒，党美娟，李 也，张 磊，向 莉，刘璟洁，张桂莲

血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)作为中枢神经系统(central nervous system，CNS)与血液之间有效的隔绝屏障，存在于所有 CNS 发育良好的生物体内[1，2]。BBB 主要由脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cell，BMEC)、星形胶质细胞足突(astrocyte end-feet)、周细胞(pericytes，PCs)、脑微血管内皮细胞间的紧密连接(tight junctions，TJs)和基膜共同组成[3～5]。其中，TJs由跨膜蛋白、胞质附着蛋白和细胞骨架蛋白共同构成，在维持 BBB 的结构和功能稳定中发挥着主要功能[2，6]。BBB各结构组成之间相互作用，构成神经血管单元(neurovascular unit，NVU)，有效抑制血管内物质的外渗，并在血液和脑之间运输各种必需的营养物质，以维持CNS微环境的动态平衡[7]。

许多病理状态可引起 BBB 的功能紊乱，包括创伤、缺氧、感染、凝血系统激活、炎症、环境毒素和遗传因素等，BBB被视为多个 CNS 疾病发生机制的中心参与者[8]。研究表明，造影剂脑病(contrast-induced encephalopathy，CIE)作为一种少见的造影剂应用并发症，其发生与BBB破坏密不可分[9～12]，TJs 的破坏可能是其中主要原因[13]。我们的前期研究表明，大鼠颈动脉注射碘佛醇可引起脑内TJs相关蛋白 ZO-1 及occludin 表达变化[14]，而造影剂对BBB超微结构的形态学影响目前尚未见报道。为此，本研究拟采用颈动脉注射碘佛醇建造脑损害大鼠模型，观察注射碘佛醇后不同时间点大鼠BBB的超微结构变化，从形态学上探索CIE的发生机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 清洁级SD健康雄性大鼠，购自空军军医大学实验动物中心，12～16周龄，体重240～280 g。安静环境饲养，室温20～25 ℃，相对湿度40%～70%，给予专用饲料，自由饮水。

1.2 实验试剂 碘佛醇(碘浓度320 mg/ml，江苏恒瑞医药股份有限公司)，伊文思兰(Evans blue，EB)(Sigma公司)，Epon812包埋剂，锇酸，醋酸铀，柠檬酸铅，丙酮，50%戊二醛。

1.3 实验分组及给药 SD大鼠根据随机数字表分为正常对照组、碘佛醇组和生理盐水组，根据给药后不同时间的选取，后两组再各自均分为给药后0.5 h、3 h、6 h和24 h四个亚组。术前禁食12 h，禁水6 h。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.4 ml/kg)麻醉后，仰卧位固定于手术台，常规备皮消毒，取颈正中旁2 mm处行长约2 cm的纵行切口，钝性分离皮下组织，暴露右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)。结扎ECA，近心端夹闭CCA，于ICA分叉处下方行CCA插管，方向朝向远心端。所用导管为聚乙烯材料制成的一种特定插管，另一端通过一个三通阀与装满肝素，以及用于给药的注射器相连。2 ml碘佛醇从CCA插管内注射，注射过程中严密观察大鼠的生命状态。生理盐水组给予等量的生理盐水，而正常对照组大鼠不予手术处理。药物注射完毕后清理切口，缝皮。将大鼠侧卧位置于安静环境下待苏醒，注意观察其生命体征。

1.4 伊文思蓝染色 本实验采用伊文思蓝作为BBB完整性的示踪剂，评估大鼠颈动脉注射碘佛醇后BBB通透性的变化程度。大鼠经尾静脉按4 ml/kg的剂量注入2%伊文思蓝溶液。成功注射EB的大鼠，可观察到其四肢、口齿、耳朵、眼球结膜、腹部皮肤等部位变蓝。30～45 min后麻醉大鼠并暴露心脏，经左心室快速灌注生理盐水至流出液变清，断头取脑，用4℃生理盐水冲洗脑组织，滤纸吸去残余水分。1 ml/100 mg 脑组织中加入甲酰胺溶液，60 ℃避光水浴48 h，5 000 r/min(r=10 cm)离心20 min，酶标仪(ELx808，BioTek，Winooski，VT，USA)于620 nm波长测光密度值，作出标准曲线，根据标准曲线计算得出样品内EB含量(μg/ml)，并按以下公式计算脑组织内EB含量。脑组织内EB含量(μg/g)= 样品EB含量(μg/ml)× 甲酰胺体积(ml)/脑组织重量(g)。

1.5 透射电镜观察

1.5.1 灌注固定液制备 电镜灌注固定液(0.25%戊二醛+4%多聚甲醛)：10%多聚甲醛 200 ml，0.2 mol/L 磷酸缓冲液 250 ml，50%戊二醛水溶液 2.5 ml，双蒸水加至500 ml。4℃保存备用。

电镜固定液(2.5%戊二醛+2%多聚甲醛)：10%多聚甲醛20 ml，0.2 mol/L 磷酸缓冲液50 ml，50%戊二醛水溶液5 ml，双蒸水加至100 ml。4 ℃保存备用。

1.5.2 电镜标本制备及观察 按上述方法行大鼠颈动脉给药，注意观察大鼠生命体征。分别取正常对照组、0.5 h、3 h、6 h、24 h组大鼠，麻醉后迅速开胸并暴露心脏，经左心室快速灌注低温生理盐水至流出液变清，再用200 ml灌注固定液快速灌注固定。断头取脑，冰上操作，快速将皮质脑组织分割成1 m3的小组织块，置于2.5%戊二醛+2%多聚甲醛固定液中，4 ℃存放。PBS漂洗，1%锇酸浸泡2 h以达到后固定。PBS漂洗，分别于70%、80%、90%丙酮溶液中浸泡15 min，最后置于100%丙酮浸泡10 min(此步骤重复一次)。Epon812环氧树脂混合液包埋标本，制成90 nm超薄切片。醋酸铀和柠檬酸铅双重染色。透射电镜(H-7650，日本，HITACHI 公司)下观察标本并拍照。

2 结 果

2.1 碘佛醇对血脑屏障通透性的影响 对脑组织EB含量的定量测定表现出与我们之前的研究一致的结果，即与正常对照组相比，给药后0.5 h脑组织内EB含量无明显差异(P>0.05)；给药后3 h脑组织内EB含量有所增加，给药后6 h组脑组织EB含量最高(均P<0.01)，24 h时EB含量显著下降，仍高于正常对照组(P<0.01)，但趋于正常(见图1)。与正常对照组相比，不同时间点生理盐水组脑组织内仅有微量EB，且无明显差异(P>0.05)(见图1)。

给予碘佛醇和生理盐水后不同时间大鼠脑组织 EB 含量比较**P<0.01 vs 正常对照组(每组大鼠n=3)

2.2 碘佛醇对血脑屏障超微结构的影响 正常对照组：脑皮质组织内皮细胞扁平，TJs结构完整，细胞周围有较厚基板(见图2A)；给药后0.5 h组：内皮细胞扁平，TJs结构基本清晰，细胞周围基板基本完整(见图2B)；给药后3 h组：内皮细胞扁平或不规则，血管腔变形，TJs结构不清晰，细胞周围基板结构疏松，血管周围可见水肿液聚集(见图2C)；给药后6 h组：内皮细胞形状不规则，部分血管腔变形、闭塞，TJs结构不清晰，细胞周围基板间断溶解，血管周围可见水肿液聚集(见图2D)；给药后24 h组：内皮细胞扁平，TJs结构基本清晰，细胞周围基板基本完整(见图2E)。图2中D1显示给药后6 h，大鼠脑皮质组织血管腔明显变形、闭塞，血管周围可见大量水肿液聚集。

A：正常对照组；B：给药后0.5 h组；C：给药后3 h组；D：给药后6 h组；E：给药后24 h组，图中箭头所指为紧密连接结构(每组大鼠n=3)

3 讨 论

造影剂可引起急性、自限性皮质盲、精神行为异常、癫痫发作、肢体瘫痪等神经功能缺损[15～17]，部分患者可危及生命[18，19]。高血压、糖尿病、肾损害、超剂量应用造影剂和既往造影剂过敏可增加 CIE发生风险[20]。虽然CIE 的发生与造影剂的渗透压或离子状态无关，但不同造影剂引起的CIE临床表现不同[16，17]。研究表明，碘佛醇是一种低渗性、非离子单体碘造影剂，对脑小动脉、毛细血管和小静脉的内皮细胞渗透作用较小，普遍认为具有良好的安全性和耐受性，但其脑损害仍有报道[16，17，21]。然而，碘佛醇引起的CIE的发生机制尚未阐明，可能与脑血管痉挛、BBB破坏、血栓栓塞及自身免疫反应有关，其中，BBB破坏可能发挥重要作用[12，22，23]。

本研究发现，造影剂的脑损害可能具有用药时间依赖性；颈动脉注射碘佛醇后0.5 h、3 h、6 h和24 h，各时间点大鼠脑内EB 含量存在先增高后降低的趋势，脑内EB含量在用药6 h最高；EB 含量的变化与TJs超微结构完整性的改变趋势一致。

临床发现，CIE 多发于用药后数小时，且多于 24～48 h 内恢复正常[17，19，20]。本研究提示，造影剂的脑损害可能具有用药时间依赖性。颈动脉注射碘佛醇后0.5 h，BBB并未发生改变，用药 3 h BBB 通透性开始升高，至6 h 达到高峰，此后逐渐下降，至24 h尚未恢复但趋于正常。同时，我们采用透射电镜观察BBB超微结构变化，结果显示，给药后0.5 h组 BBB 超微结构较正常对照组变化不大，而给药后3 h和6 h组 BBB 结构明显破坏，其中6 h组内皮细胞形状不规则，TJs结构更加模糊，细胞周围基板间断溶解；给药后24 h组 BBB 结构类似0.5 h组，与正常对照组形态结构相比没有显著的变化。这与 EB 染色的结果大抵相同，共同印证了短时间内造影剂的使用会增加 BBB 通透性的观点，进一步证实碘佛醇对大鼠 BBB 通透性的影响。提示在临床工作中，用药后6 h可能是 CIE发生的关键时间点。

BBB作为维持CNS稳态的重要结构，其功能障碍与许多CNS疾病的发生密切相关。这种障碍可能是短暂、轻度的 TJs 开放，也可能是慢性持续性的 BBB 破坏，甚至可以引起转运蛋白的改变。研究表明，缺血、缺氧、肿瘤、感染等因素会引起TJs的结构和功能变化，导致 BBB 通透性改变，引起脑水肿、神经炎性反应、神经功能缺损等[3，24]。本研究从形态学角度发现颈动脉注射碘佛醇后大鼠脑内TJs的结构改变，结合我们既往对TJs蛋白的研究[14]，进一步证实注射碘佛醇后引起TJs开放对BBB通透性的影响。因此，早期针对TJs的干预可能是CIE防治的关键点。然而，BBB 的开放具有双重意义，严重持续的病理损害可以导致疾病的发生，但短暂、定向、适度的开放有助于部分CNS疾病的治疗[25]。碘佛醇引起的大鼠BBB的改变，呈现为短暂、可逆性的开放，也许为 BBB 开放及 CNS 疾病药物传递提供了一种新思路。

另外，本研究还发现，单次注射碘佛醇后可诱发脑血管痉挛。在给药后6 h组，本研究发现，脑小血管的管腔发生明显变形，甚至闭塞，提示脑小血管脑血管痉挛与 BBB 破坏可能共同参与了造影剂脑损害的发生、发展过程，值得进一步研究证实。

总之，本研究发现，颈动脉注射碘佛醇后可引起大鼠 BBB时间依赖性通透性及超微结构的可逆性改变，BBB通透性的动态变化与TJs的超微结构改变有关，从形态学角度反映了BBB破坏参与CIE的发病机制。