基于网络药理学研究葛根芩连汤治疗溃疡性结肠炎的分子作用机制

★吴成成 黄海鹏 罗文兵（.江西中医药大学附属医院 南昌 0006；.新余市中医院 江西 新余 8000；.分宜县中医院 江西 分宜 6600）

溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）是一种病因尚不十分清楚的结肠和直肠慢性非特异性炎症性疾病，病变多位于乙状结肠和直肠，病程较长、亦反复发作，且部分患者最终可能发展成结直肠癌，目前其发病率在我国呈持续上升趋势［1］。西医治疗该病尚无特效药，以对症治疗为主，部分西药因存在肝肾损伤、患者依从性差等原因，导致临床疗效不佳［2-3］。中药葛根芩连汤治疗该病由来已久，临床效果较好，但其具体作用机制目前尚未完全清楚。因此，探讨该方治疗UC的具体分子机制对其临床治疗、运用具有重要意义。

网络药理学是2007年提出的一种用系统生物学方法来进行药理学研究的新型技术方法，是基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用的网络，能系统综合地观察药物对疾病网络的干预与影响，这与中药复方的多成分、多途径、多靶点协同作用的原理相似［4-5］。因此，本文采用该方法对葛根芩连汤治疗溃疡性结肠炎的分子作用机制进行研究。

1 方法

1.1 药物成分及靶点的查询及筛选 在TCMSP数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）以OB≥30 %或DL≥0.18为阈值对葛根芩连汤中药物成分进行筛选［6］。将筛选后的化合物输入BATMAN-TCM数据库（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）中，以得分（Score）≥20与调整P值（Adjusted P-value）＜0.05为临界值进行药物靶标的筛选［7］。

1.2 UC相关基因的检索 在数据库DisGeNET［8］（http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu）中输入溃疡性结肠炎名称，查找与其相关的疾病基因。

1.3 葛根芩连汤治疗UC的靶标蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction， PPI）分析及网络可视化构建 将葛根芩连汤预测所得的基因与UC基因进行映射，得出该方治疗UC的作用基因，并将其输入STRING数据库［9］进行PPI分析。在分析过程中，选取PPI得分大于0.4的基因输入Cytoscape软件（3.2.1）进行网络可视化。应用软件中的Network Analysis plugin对网络图中节点（Node）进行统计，分析其在图中的作用——自由度（Degree）。自由度越大，该节点在网络中的生物功能则越多。以Degree大小对节点颜色进行渲染，从黄色渐变到红色，黄色代表该节点自由度较小，红色代表该节点自由度较大。

1.4 基因本体（Gene Ontology，GO）、KEGG PATHWAY通路富集 将上述所得的作用基因输入DAVID数据库（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）［10］进行GO、KEGG分析，以调整P值＜0.05为标准进行筛选。

1.5 葛根芩连汤治疗UC“成分-靶标-信号通路”网络构建 将葛根芩连汤中有效的作用成分、其作用靶标、信号通路输入Cytoscape 3.2.1软件，构建“成分-靶标-信号通路”网络图。

2 结果

2.1 葛根芩连汤治疗溃疡性结肠炎潜在靶标 基于DisGeNET数据库查询所得，有914个基因与UC相关。通过TCMSP及BATMAN-TCM数据库筛选后发现葛根芩连汤治疗UC的作用基因有155个，有效成分有127个。

2.2 葛根芩连汤治疗UC“蛋白-蛋白”相互作用图 由图1可知，有153个节点符合条件，聚类系数为0.555，网络密度为0.169。运用CytoHubba软件根据节点自由度大小进行排列，挑选前10个作为葛根芩连汤治疗UC的关键蛋白，见图2及表1。

2.3 葛根芩连汤治疗UC作用基因的KEGG PATHWAY通路富集 用DAVID 6.8数据库进行在线通路富集，经过筛选后有21个通路，其中包括NF-kB、HIF-1、NOD样受体等信号通路，见图3。

2.4 葛根芩连汤治疗UC作用基因GO分析 运用DAVID数据库进行GO分析，最终得出：其生物过程（biological process, BP）主要集中在细胞对化学刺激的反应、炎症反应、对含氧化合物的反应、防御反应等几个方面，细胞组成（cellular component，CC）主要集中在细胞表面、细胞外部分、质膜外侧面等，分子功能（Molecular Function，MF）主要表现在受体结合、细胞因子活性等，见表2。

2.5 葛根芩连汤治疗UC“重要成分-靶标”图 将葛根芩连汤中有效成分、靶基因输入Cytoscape 3.2.1软件中，以Degree≥5为标准进行筛选构建“重要成分-靶标”图。图中红色棱形节点代表作用基因，黄色圆形节点代表药物中的小分子化合物，见图4。

图1 葛根芩连汤治疗UC中PPI网络图

表1 葛根芩连汤治疗UC中PPI关键基因

图2 葛根芩连汤治疗UC中PPI网络关键基因

图3 葛根芩连汤治疗UC的通路富集图

表2 GO分析结果

图4 葛根芩连汤治疗UC“重要成分-靶标”图

3 讨论

溃疡性结肠炎在中医学中属“泄泻”“痢疾”“肠癖”等范畴，多因湿热壅滞肠道而致下利脓血。葛根芩连汤源自《伤寒论》，君药葛根辛甘而凉，入脾胃经，既能解表退热，又能升脾胃清阳之气而治下利；黄连、黄芩清热燥湿、厚肠止利；甘草可调和诸药，此方为表里双解剂，有治下利的作用，临床用于治疗UC疗效佳，然其具体作用机制尚不完全清楚［11］。因此，本文采用网络药理学方法对其进行探讨。

通过网络药理学预测发现，葛根芩连汤中有127个有效成分可用于治疗UC，其中作用的靶基因有155个、分子信号通路22个。从 PPI分析可见，该方作用的关键靶基因为肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）、白介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β、白介素2（interleukin-2，IL-2）、白介素10（interleukin-10，IL-10）等， 这与之前文献报道相符［12-14］。TNF与IL-6、IL-10、IL-2均是炎症介质的一种。UC发病原因尚不明确，普遍认为与感染、遗传、免疫等因素相关。UC患者临床症状大多表现为炎症反应，肠组织中多有炎性细胞浸润，炎症反应为认为是该病发病机制中最重要的因素之一［15］。TNF、IL-1β、IL-6、IL-10等炎性细胞因子可使中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞在肠壁聚集，导致肠黏膜上的炎症反应放大，促进促炎因子的分泌，形成级联炎症反应，加重肠道炎症的发展［16］。葛根芩连汤作用的22个信号通路中包括NF-kB、HIF-1、NOD样受体等信号通路，其中NF-kB通路是UC发病过程中肠道炎症反应的中心环节，可调节免疫和炎症反应相关的多种基因［17］；HIF-1为缺氧诱导因子，与肠道粘膜屏障功能的维持、修复及免疫炎症等相关，多有研究报道其在UC发病中常呈上调状态［18］；NOD样受体属天然免疫系统，其参与细胞内细菌病原体相关分子模式的识别并可诱发炎症反应，长期功能失调可导致慢性炎症性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等的发生［19］。目前已有文献报道该方对NF-kB具有调节作用［13］，然对HIF-1、NOD样受体信号通路的影响尚未可知，此将作为本课题组后续的研究方向之一。