中药材白接骨离体再生与快速繁殖

赵婷，史颖，刘东来，陈永勤

(湖北大学生命科学学院， 湖北 武汉 430062)

0 引言

白接骨(Asystasiellaneesiana(Wall.) Lindau)为爵床科白接骨属植物，是我国重要的传统中药材之一，其干燥的根茎及叶具有化瘀止血、续筋接骨、利尿消肿、清热解毒等功效，主治吐血、便血、外伤出血、跌打损伤、腹水水肿、咽喉肿痛、疮痈肿毒等症[1].白接骨在我国分布较广，有多种别称，如接骨丹、接骨草、玉接骨、玉龙盘、血见愁、麒麟草、玉连环、金不换等[1].

研究表明，白接骨有显著的抑菌作用.李芝芳等[2]发现，白接骨水提取液对普通化脓及创伤感染中常见的细菌(如金黄色葡萄球菌、链球菌、八叠球菌、破伤风杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌、大肠杆菌等)都有抑制作用，尤其是对金黄色葡萄球菌最为敏感.张森等[3]比较了白接骨水提液和醇提液对大肠杆菌、沙门氏杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌的抑菌效果，发现醇提液的效果显著好于水提液.张森等[4]还发现白接骨醇提物对标准大肠杆菌菌株和对甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、头孢曲松、环丙沙星等药物具有多重耐药性的猪源大肠杆菌菌株都有较好的抑菌效果.

目前，白接骨可以通过种子进行繁殖.但是，白接骨结实率较低、种子数量少，每果只有4粒种子，而且遗传杂合的品种(植株)不宜用种子繁殖.此外，白接骨也可以通过分株方法进行无性繁殖，但速度较慢.植物组织培养是在无菌条件下培养各种植物材料使其长出人们所需要的细胞、组织、器官或植株.植物组织培养的植株再生技术可以用于快速、高效繁殖植物，所生产的组培苗健壮、整齐，为规范化、标准化栽培创造了条件.人们还可以根据需要利用植物组培技术去除原植物体内的病原菌和病毒(即脱毒培养)，脱毒组培苗的应用可以大大降低病害发生的危险，从而更好地保持优良品种的原有特性.植物组培苗生产技术在一些农作物、果树、花卉和经济林业树种上得到了广泛应用，并取得了巨大的经济效益和社会效益.中药材是中医中药的基础，药用植物组培技术也一直受到人们的高度重视，很多重要中药材的组织培养与快速繁殖技术获得了成功并用于组培苗生产，如人参[5-6]、山药[7]、地黄[8]、枸杞[9-10]、甘草[11]、丹参[12]、铁皮石斛[13]、白芨[14]、金线莲[15]等.

迄今，白接骨组织培养在国内外学术期刊上少见报道.因此，本文报道植物激素对白接骨芽诱导、增殖和生根的影响，以及组培苗移栽技术.本研究结果将为白接骨组培苗生产和转基因研究提供参考.

1 材料与方法

1.1 植物材料白接骨采于江西省九江市，种于温室内花盆中，常规护养.

1.2 培养基和培养条件本试验所用的基本培养基为添加20 g/L的蔗糖和7 g/L琼脂的MS培养基[16].初代茎段培养基含0.5 mg/L 6-苄基氨基嘌呤(BA)，芽增殖培养基含0.5 mg/L BA和不同浓度赤霉素(GA3).在不同细胞分裂素对芽增殖影响的试验中，所用的细胞分裂素为BA，激动素(KT)和噻苯隆(TDZ)，浓度见表1.不定芽诱导培养基中添加0.2 mg/L萘乙酸(NAA)和不同浓度BA或TDZ(表2).生根培养基添加不同浓度吲哚丁酸(IBA)(表3).所有培养基的pH值调至5.8，121 ℃消毒15 min.

培养室温度为(25 ± 1) ℃，培养架的光照强度为30～40 μmol m-2s-1，光周期为光照16 h/黑暗8 h.

1.3 外植体消毒与培养取生长健壮的白接骨茎，剪去叶片，用自来水和家用洗涤剂(雕牌)小心清洗后，将茎剪成带节的小段(3 ～ 4 cm长)，在含1%有效氯的次氯酸钠溶液中消毒15 min.然后，用无菌水漂洗3次，再切除两端，将带节的茎段(0.5 ～ 0.7 cm长)接种到初代茎段培养基上.

1.4 芽增殖培养在合适的芽增殖培养基上，芽每30 d继代增殖1次.继代时，将幼茎切成带芽的小段，再接到新鲜的增殖培养基上.

1.5 不同细胞分裂素对芽增殖的影响为了获得更好的芽(幼茎)增殖培养基配方，将增殖培养基上形成的幼茎切成带芽的小段，接到含不同种类和不同浓度细胞分裂素的培养基上.30 d后，根据幼茎数、芽增殖效率和幼茎生长情况，确定适合芽增殖的细胞分裂素种类和浓度.

1.6 不定芽诱导将增殖培养基上幼茎的叶片切成约0.5 cm长的小块，接种到不定芽诱导培养基上，诱导时间为50 d.不定芽形成后，再转到芽增殖培养培养基上进行增殖.

1.7 植株再生与组培苗移栽将增殖培养基上形成的幼茎切成2～3 cm长，接种到不同的生根培养基上诱导生根.组培苗生根后，将其取出，用自来水洗去附着的培养基，在温室栽入由泥炭土、蛭石和珍珠岩(7∶2∶1)配制的基质中(容器为穴盘)，浇透水.以后根据需要浇水，每7 d喷洒2次MS培养基无机盐营养液.温室的温度为24～28 ℃，相对湿度为60%～80%，自然光，光强大约为自然光照的2/3.生长30 d后，将温室的组培苗移栽到室外的试验地中.

1.8 数据统计分析细胞分裂素对芽增殖的影响、不定芽诱导和生根等处理试验均重复3次，每个处理每次重复接种4或6瓶、每瓶10个材料.用SPSS 20.0软件进行数据统计分析，处理间的差异显著性分析采用Duncan新复极差法.

2 结果与分析

2.1 茎段培养与芽增殖茎段接种到初代茎段培养基上3 d后开始出现污染，14 d后污染率为70%(32/46).接种后5 d，部分茎段上的侧芽开始膨大、变绿，随后伸长.在培养的46个茎段中，有38个(包括污染的茎段)发生了侧芽的生长，侧芽发生率达82.6%，35 d后没有污染的茎段产生1或2个伸长的新幼茎(图1A).

图1 白接骨离体植株再生与繁殖A.初代培养基上茎段形成的幼茎；B.在含0.5 mg/L BA和0.3 mg/L GA3培养基上形成的纤细幼茎；C. 在含0.5 mg/L BA和0.05 mg/L GA3培养基上一个茎段形成的健康幼茎；D.在含1 mg/L BA和0.05 mg/L GA3培养基上的一个茎段所形成的丛生幼茎，生长正常；E. 在含1 mg/L TDZ和0.2 mg/L NAA培养基上叶片分化的不定芽(箭头所指)；F. 在含1 mg/L IBA培养基上生根良好的再生植株

表1 细胞分裂素对白接骨幼茎增殖的影响

将新幼茎切成带节的小段、接种到新鲜初代茎段培养基上，14 d后除带顶芽的茎段外，带侧芽的茎段都没有明显生长.将其转到含0.3 mg/L赤霉素(GA3)和0.5 mg/L BA的培养基上，5 d后所有茎段上的芽生长明显. 随后，显著伸长，30 d后形成的幼茎纤细、节数少(图1B).为了探索适合的赤霉素浓度，将幼茎切成带顶芽或侧芽的小段、分别接种到含0.02、0.05、0.10、0.15和0.20 mg/L GA3培养基上.在30 d的培养时间内，所有茎段上的芽都能有效伸长，其中0.10、0.15和0.20 mg/L GA3培养基上的幼茎伸长显著，但纤细、节数少.在0.02和0.05 mg/L GA3培养基上的幼茎较粗壮，生长正常(图1C).随后，芽的增殖在含0.5 mg/L BA和0.05 mg/L GA3的MS培养基上进行，每30 d增殖一次.

2.2 不同细胞分裂素对幼茎增殖的影响由表1可知，细胞分裂素的种类及浓度对白接骨的芽增殖有较大影响.总地来说，芽(幼茎)数量和增殖系数都随细胞分裂素浓度的增加而增加.在所试验的3种细胞分裂素中，激动素(KT)的效果最差，平均幼茎数/茎段和增殖系数在2 mg/L时最高，分别为1.9和3.5，均显著低于BA和TDZ处理的相应指标.TDZ促进幼茎增殖的效果最好，0.2、0.5和1 mg/L三个处理的平均幼茎数/茎段分别为3.6、3.9和4.2，几乎都显著高于BA和KT的各个处理.但在TDZ培养基上，幼茎伸长和叶片伸展受到了显著抑制，与1 mg/L和2 mg/L BA处理相比，其繁殖系数并没有优势；另外，在0.5和1 mg/L TDZ培养基上幼茎还出现明显的玻璃化现象.相比之下，BA最适合白接骨的幼茎增殖，效果与浓度有关.在BA浓度为2 mg/L时，平均芽数和增殖效率最高，分别为3.2和6.4，但部分幼茎也有玻璃化现象；而在1 mg/L时，增殖效果比较好，平均幼茎数/茎段和增殖效率分别为2.6和5.9，幼茎较粗、叶片伸展，无玻璃化现象(图1D).

2.3 不定芽的诱导与增殖在各种不定芽诱导培养基上，10 d后部分叶块的伤口处出现愈伤组织，至21 d时愈伤组织产生率达到100%.在50 d的诱导期间，所有BA培养基上的叶块都没有形成不定芽，愈伤组织大都变褐，甚至死亡；4种TDZ培养基都有少数叶块分化了不定芽(图1E).其中，以1 mg/L TDZ的诱导率最高，为24.2%(表2).在TDZ诱导培养基上不定芽几乎不伸长，转到含1 mg/L BA和0.05 mg/L GA3的芽增殖培养基上后，它们都能正常伸长并增殖.

表2 BA和TDZ对白接骨叶片外植体分化不定芽的影响

2.4 芽生根与组培苗移栽将增殖培养基上所形成的幼茎接种到含不同浓度IBA的生根培养基上，7～10 d后基部开始出现根，20 d后生根率达到100%.虽然，在无激素培养基上白接骨幼茎能100%生根，但添加IBA可以促进早生根、多生根(表3，图1F).在2 mg/L IBA培养基上，再生植株的根数最多，但基部的愈伤组织也比较大.因此，IBA浓度以1或1.5 mg/L为宜.

表3 IBA对白接骨幼茎生根的影响

2019年3月上旬，在温室进行组培苗移栽试验，共移栽8个穴盘，共256株.移栽7 d后，组培苗生长明显，茎伸长、叶变大；30 d后组培苗成活率为96.5%(247/256)，生长健壮，部分组培苗形成了丛生苗(图2A).将这些驯化的组培苗移栽到室外试验地后，成活率达到100%，植株生长良好，并在5月下旬开花(图2B).

3 讨论

茎段培养是植物组培苗生产的首选方法.它不仅操作简单，而且组培苗变异的几率最小.在进行茎段培养时，芽的萌动生长率及其随后的伸长、生长情况对繁殖效率有决定性的影响.植物激素在这两方面具有重要调节作用，通过筛选激素种类和浓度可以得到最佳的芽增殖培养基.

图2 白接骨组培苗移栽A. 温室中移栽30 d后的组培苗，生长良好；B.移栽到试验地60 d后的驯化组培苗，生长旺盛并开花

自然条件下，白接骨基部的芽能萌动生长和伸长，进一步生根.我们发现，在离体条件下，白接骨茎段上的芽在含0.5 mg/L BA的培养基上不能有效伸长，因而严重影响芽的增殖效率.但是，在培养基中添加低浓度(0.02～0.05 mg/L)赤霉素GA3能有效地解决这个问题.

细胞分裂素具有诱导芽分化和促进芽增殖的作用.传统的细胞分裂素都是嘌呤衍生物，如天然的玉米素(zeatin，ZT)和N6-异戊烯基腺嘌呤(2iP)、及人工合成的激动素(KT)和N6-苄基氨基嘌呤(BA).噻苯隆(TDZ)是上世纪末人工合成的苯基脲衍生物，为棉花脱叶剂.后来发现其具有强烈的细胞分裂素活性，甚至超过传统的细胞分裂素[17-18]，已成为植物组织培养中常用的细胞分裂素之一.同一植物对不同的细胞分裂素往往反应不一样，如Ellis等比较了BA、ZT和TDZ诱导白云杉不定芽的效果，发现ZT最好[19]；Joo等在进行栝楼的茎段培养时，发现KT促进芽增殖的效果远远好于ZT、2iP、BA和TDZ[20].在本研究中，我们发现TDZ促进白接骨茎段形成新幼茎的能力显著高于KT和BA，但对幼茎的生长有负作用(抑制幼茎伸长、叶片伸展，并导致玻璃化.因此，TDZ并不适合白接骨芽的增殖.TDZ抑制芽生长的负作用在米糕果[21]、白鹤芋[22]和香蕉[23]等植物上也有报道.从芽的增殖效率和生长情况来看，BA更适合白接骨，在含1 mg/L BA和0.05 mg/L GA3的培养基上，1个芽诱导培养30 d可以增殖5.9倍(表1)，而且，不定芽生长正常、后期能正常生根.按此繁殖效率，理论上,用1个白接骨芽1年就可以生产2亿多株组培苗.

建立白接骨的不定芽诱导技术不仅可以用于快速繁殖，还可以用于培育转基因植株，对于今后利用转基因技术对其进行遗传改良有重要意义.尽管BA可以有效地促进白接骨芽的增殖，但在试验的浓度范围内(1～5 mg/L)并没有诱导叶片外植体形成不定芽，而0.5～2 mg/L TDZ可以，最佳浓度为1 mg/L，诱导率为24%.生根关系到组培苗的质量.生长素常用来诱导、促进生根.虽然，白接骨的幼茎在无激素培养基上也能有效生根，但添加1或1.5 mg/L IBA能显著改善生根效果.再生的组培苗根多、且较粗壮，有利于组培苗移栽后的成活和生长.

总之，本研究成功建立了以茎段和叶片为外植体的白接骨离体再生与快速繁殖技术，为白接骨的组培苗生产和基因工程研究提供了参考.