塞来昔布对食管癌细胞侵袭的抑制作用及机制

赵晓伟，李思源，肖智伟，李 军，赵梦瑶，蔺茹君，冀雪姣

(1.石河子大学医学院第一附属医院内分泌代谢科，新疆 石河子 832000；2.石河子大学医学院，新疆 石河子 832000；3.中国人民解放军69296部队，新疆 喀什 844200)

食管癌位居全世界常见恶性肿瘤的第8位[1]。食管癌疾病进展、术后复发、预后差的重要原因之一是食管癌侵袭及转移[2]，探索抑制食管癌细胞侵袭转移的方法是目前食管癌研究的热点之一。COX-2在正常组织中表达几乎为零，而在促癌因素、癌基因等病理因素刺激作用下，在局部组织中可迅速高表达[3-4]。COX-2主要是通过促进细胞增殖和侵袭[5]发挥促进肿瘤生长作用。研究表明使用非甾体类消炎药或特异性COX- 2抑制剂可抑制胃腺癌细胞的增殖、侵袭及生长活性[6]。MMP-14是基质金属蛋白酶(MMPs)中的一种，是以酶原形式由瘤细胞及间质细胞产生和分泌[7]的蛋白水解酶，经水解后激活。MMP-14的过度表达，利于癌细胞的转移，主要是通过破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障发挥作用[7-10]。在肿瘤细胞中MMP-14高表达，且癌细胞侵袭和转移程度及肿瘤进展与MMP-14的高表达密切相关,是肿瘤患者预后的重要指标之一。本试验拟研究COX-2抑制剂塞来昔布对食管癌细胞系侵袭作用的影响及机制，为食管癌机制的研究及防治提供依据。

1 材料与方法

1.1主要实验材料：购自上海中国科学院细胞库的人食管癌EC109细胞系。购自美国pfizer pharmaceuticals LLC公司的塞来昔布。购自美国GIBCO公司的胎牛血清(FBS)、细胞培养基(DMEM)。购自美国CORNING公司的Trans well小室(8 μm)。购自美国Becton Dickinson公司的基质胶(Matrigel)。购自美国SIGMA公司的二甲基亚砜(DMSO)。购自美国SIGMA公司的结晶紫。

1.2方法

1.2.1细胞培养：在5% 二氧化碳恒温37 ℃培养箱环境中，将人食管癌EC109细胞加入培养基(含10%胎牛血清的DMEM)中培养，取其对数期细胞制备成105/ml的单细胞悬液进行实验。

1.2.2细胞分组处理；以塞来昔布终浓度分组，分别为0 μmol/L、20 μmol/L、60 μmol/L、100 μmol/L组。

1.2.3蛋白浓度测定：ELISA法测定塞来昔布(0 μmol/L、20 μmol/L、60 μmol/L、100 μmol/L)作用下EC109细胞胞内MMP-14蛋白的相对浓度。

1.2.4Transwell侵袭实验：每个小室镜下观察可随机选取5个视野计数，以穿过聚碳脂膜的细胞数目来评估食管癌EC109细胞侵袭能力。

2 结果

2.1EC109细胞在各塞来昔布组作用下的MMP-14蛋白相对浓度：EC109细胞被四组塞来昔布处理24 h后，ELISA测定EC109细胞内的MMP-14蛋白表达水平，0 μmol/L塞来昔布组为11.517±0.881,20 μmol/L塞来昔布组为7.905±0.724,60 μmol/L塞来昔布组为5.788±0.750,100 μmol/L塞来昔布组为3.663±0.601，差异有统计学意义(P<0.05)；可见在0～100 μmol /L之间，随着塞来昔布药物浓度的递增，细胞内MMP-14蛋白表达逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。

表1 EC109细胞在各组塞来昔布作用下的MMP-14蛋白表达水平

注：与0 μmol/L塞来昔布组比较，*P<0.05

2.2EC109细胞侵袭能力在各塞来昔布组作用下的变化：各组塞来昔布处理EC109细胞24 h后， Transwell侵袭实验中，穿过小室基质胶的细胞数，0 μmol/L组为258.200±16.991，20 μmol/L组为170.200±12.498，60 μmol/L组为85.600±8.905，100 μmol/L组为40.200±8.585，差异有统计学意义(F=309.910，P<0.05)；可见随着塞来昔布药物浓度在0～100 μmol /L之间递增，EC109细胞的侵袭能力逐渐降低。见图2、图3。

注：A：对照组；B：20 μmol/L塞来昔布组；C：60 μmol/L塞来昔布组；D：100 μmol/L塞来昔布组

3 讨论

我国是食管癌新发病例数最多的国家[11]。侵袭和转移是导致食管癌恶化因素之一[2]。近来研究表明肿瘤细胞的生长、侵袭和转移与MMP-14在肿瘤组织中的高表达有相关性。MMP-14在多种肿瘤组织中，如胃癌[12-13]、结直肠癌[14-15]、原发性肝癌[16]、乳腺癌[17-18]、胰腺癌[19]等肿瘤组织均有过度表达，且MMP-14高表达的癌细胞侵袭能力与MMP-14非高表达相比增强。MMP-14是影响预后的重要因素[20]。

图3 各塞来昔布处理组侵袭细胞的个数比较

COX-2是在炎性介质[21]、多种促癌因素[22-23]等因素作用下高表达的诱导型酶。其主要是通过降解细胞外基质，对肿瘤细胞增殖、侵袭及转移有促进作用，对凋亡[2]有抑制作用。肿瘤组织中COX-2，MMP-14不仅均有高表达且两者相关联[24]，COX-2的高表达可同时伴有MMP-14蛋白表达的显著增高，COX-2表达下调可使MMP-14蛋白表达降低，且肿瘤细胞的增殖、侵袭能力明显降低[25-26]。刘卫梅等研究表明在甲状腺癌患者较甲状腺良性病变中COX-2和MMP-14阳性表达率高，而两者在甲状腺体正常组织中不表达[24]。易松等在肾癌中的研究表明，组织中MMP-14高表达可能是促进肾癌浸润和转移的因素之一[27]。

食管癌组织中COX-2存在持续性高表达。塞来昔布是选择性 COX-2抑制剂，其发挥抗炎和抗肿瘤作用[28]，但具体的机制尚不清楚。本实验测定食管癌EC109细胞中MMP-14蛋白表达，结果显示，随着塞来昔布药物浓度递增(在0～100 μmol/L之间)，细胞内MMP-14蛋白相对浓度逐渐下降，说明COX-2可抑制MMP-14的表达。Transwell侵袭实验结果显示，EC109细胞侵袭能力与塞来昔布呈浓度依赖性。说明MMP-14蛋白的高表达和食管鳞癌的浸润转移有关,且呈负相关，MMP-14蛋白的高表达抑制食管鳞癌的浸润转移。因MMP-14和肿瘤细胞的转移密切相关，所以随着COX-2抑制剂浓度的增加，癌细胞侵袭能力下降，笔者的研究结果就验证了这一点。 这与刘卫梅[24]、易松[27]随塞来昔布浓度增加MMP-14蛋白表达逐渐降低的结果相一致。本实验研究结果表明COX-2抑制剂塞来昔布通过抑制COX-2，降低EC109细胞内MMP-14蛋白的表达，抑制EC109细胞侵袭。

综上所述，本研究表明COX-2抑制剂塞来昔布可能通过抑制MMP-14蛋白表达，抑制食管癌EC109细胞的侵袭，这为食管癌的防治及靶向药物的研制提供了依据。目前也有塞来昔布与常规化学治疗药物的联合治疗直肠癌[29]、口腔癌[30]、卵巢癌[31]、胃癌[32]等疾病在动物试验及临床试验中的研究，且目前可以被认为是增强抗癌药物的治疗功效的药物[33]，但机制尚不明确，仍需要在Bax基因促进细胞凋亡，NF-κB信号通路的Cyclin D1靶基因,抑制肿瘤细胞增殖及肿瘤组织中血管形成及生长着过程等方面的研究 。目前也有些合成的MMP抑制剂应用于临床试验，随着研究的不断深入，将会为肿瘤治疗提供更多方法。