UPLC同时测定疏风解毒胶囊中10个化学成分含量

王日成

中国科学技术大学 附属第一医院，安徽 合肥 230001

疏风解毒胶囊是由虎杖、连翘、板蓝根、柴胡、败酱草、马鞭草、芦根、甘草8味中药制备而成的复方制剂，具有疏风清热、解毒利咽的功效，临床用于发热、恶心、咽痛、头痛、鼻塞、流浊涕、咳嗽等急性上呼吸道感染属风热证及流感的防治，体内外研究表明，其疗效确切[1-2]。现行质量控制标准为国家食品药品监督管理局标准(YBZ00652009)，采用薄层扫描法测定虎杖中大黄素的含量[3]。但疏风解毒胶囊中多种化学成分已被证实有明确药理活性，如方中虎杖[4](虎杖苷、大黄素8-O-葡萄糖苷、大黄酸、大黄酚)具有利湿退黄、清热解毒、散瘀止痛、止咳化痰的功效，连翘[5](连翘苷、连翘酯苷A)具有清热、解毒、散结、消肿的功效，马鞭草[6](马鞭草苷)具有凉血、散瘀、通经、清热、解毒、止痒、驱虫、消胀的功效，甘草[7](甘草酸铵)具有清热解毒、祛痰止咳、脘腹的功效，故仅以大黄素做为唯一质控指标难以全面体现疏风解毒胶囊的内在质量。现有文献资料[8-11]采用高效液相色谱法(HPLC)测定疏风解毒胶囊中的虎杖苷、马鞭草苷、连翘苷等成分，尚未有采用超高效液相色谱法(UPLC)同时定量测定疏风解毒胶囊中多种成分的文献报道。本研究采用UPLC测定疏风解毒胶囊中马鞭草苷、虎杖苷、连翘苷、连翘酯苷A、芦荟大黄素、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄酸、甘草酸铵、大黄素、大黄酚10个指标成分含量，以期全面、有效评价其质量，完善质量评价标准，为进一步的临床研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

ACQUITY UPLC超高效液相色谱系统(美国Waters公司)；ABS-135S型电子天平(d=0.01 mg，瑞士梅特勒公司)；AS1001K型数控超声波清洗器(天津奥特赛恩斯公司)。

1.2 试药

对照品连翘苷(批号：110821-201615，纯度：94.9%)、连翘酯苷A(批号：111810-201707，纯度：97.2%)、芦荟大黄素(批号：110795-201609，纯度：98.1%)、大黄酸(批号：110757-201607，纯度：99.3%)、甘草酸铵(批号：110731-201720，纯度：97.7%)、大黄素(批号：110756-201512，纯度：98.7%)、大黄酚(批号：110796-201520，纯度：99.2%)均购自中国食品药品检定研究院；马鞭草苷(成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：M-042，纯度≥98%)；虎杖苷(成都曼思特生物科技有限公司，批号：A0052，纯度：98%)；大黄素8-O-葡萄糖苷(成都克洛玛生物科技有限公司，批号：130822，纯度≥98%)。

疏风解毒胶囊由安徽济人药业有限公司提供，批号分别为160511、160922、170204、170516、170709、170715、170824、180104、180514；甲醇、乙腈均为色谱纯(默克公司)；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLCTMC18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～3 min，10%A；3～6 min，10%～30%A；6～11 min，30%～40%A；11～17 min，40%～80%A；17～19 min，80%A；19～20 min，80%～10%A)；流速为0.3 mL·min-1；检测波长为250 nm；柱温为30 ℃；进样量为2 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液的制备 精密称取对照品马鞭草苷、虎杖苷、连翘苷、连翘酯苷A、芦荟大黄素、大黄素8-O-葡萄糖苷、大黄酸、甘草酸铵、大黄素、大黄酚适量，加甲醇超声溶解并定容，制成分别含马鞭草苷0.545 mg·mL-1、虎杖苷1.082 mg·mL-1、连翘苷0.213 mg·mL-1、连翘酯苷A0.636 mg·mL-1、芦荟大黄素0.381 mg·mL-1、大黄素8-O-葡萄糖苷0.035 mg·mL-1、大黄酸0.079 mg·mL-1、甘草酸铵0.793 mg·mL-1、大黄素0.561 mg·mL-1、大黄酚0.018 mg·mL-1的混合对照品溶液(以上对照品质量浓度已按对照品纯度折算)，室温避光保存，备用。

精密吸取混合对照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，分别置10 mL量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，得系列混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备 疏风解毒胶囊20粒，取内容物混合均匀，精密称定约1.0 g，置100 mL圆底烧瓶中，加入稀乙醇50 mL，称定质量，加热回流提取2 h，冷却后称定质量并用稀乙醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液，室温避光保存。

2.3 方法学考察

2.3.1系统适用性试验 分别精密吸取2.2项下的供试品溶液、混合对照品溶液及空白溶剂，按2.1项下色谱条件测定，结果10个化学成分均可达到基线分离，与相邻色谱峰之间的分离度>1.5，理论塔板数按虎杖苷计>15 000，对称因子均小于1.2，空白溶剂对测定结果均无干扰。色谱图见图1。

注：A.供试品；B.混合对照品；C.空白样品；1.马鞭草苷；2.虎杖苷；3.连翘苷；4.连翘酯苷A；5.芦荟大黄素；6.大黄素8-O-葡萄糖苷；7.大黄酸；8.甘草酸铵；9.大黄素；10.大黄酚。

2.3.2线性关系考察 取2.2.2项下系列混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件测定，记录色谱图。以质量浓度对峰面积进行线性回归，计算10个化学成分回归方程和相关系数(r)，见表1。

表1 疏风解毒胶囊中10种化学成分的回归方程及线性范围

精密量取2.2.1项下混合对照品溶液，用稀乙醇倍比稀释，按2.1项下液相色谱条件分析，取各成分峰信噪比S/N为10时的混合对照品溶液浓度为定量限(LOQ)，结果马鞭草苷、虎杖苷、连翘苷、连翘酯苷A、芦荟大黄素、大黄素8-O-葡萄糖苷、大黄酸、甘草酸铵、大黄素和大黄酚LOQ分别为4.33、6.08、3.27、3.49、3.81、0.024、1.36、2.99、2.73、0.51 μg·mL-1。

2.3.3精密度试验 精密吸取混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件重复进样6次，记录色谱图并计算10个化学成分峰面积RSD。结果马鞭草苷、虎杖苷、连翘苷、连翘酯苷A、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素8-O-葡萄糖苷、甘草酸铵、大黄素、大黄酚峰面积RSD分别为0.33%、0.26%、0.19%、0.57%、0.43%、0.48%、0.32%、1.01%、0.97%、0.71%(n=6)，仪器精密度符合要求。

2.3.4稳定性试验 取同一供试品溶液(批号：20180526)，分别于0、4、8、12、16、20、24 h按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图并计算10个成分峰面积RSD。结果马鞭草苷、虎杖苷、连翘苷、连翘酯苷A、芦荟大黄素、大黄素8-O-葡萄糖苷、大黄酸、甘草酸铵、大黄素、大黄酚峰面积RSD分别为1.64%、1.72%、1.00%、2.14%、1.51%、2.62%、1.84%、1.50%、2.21%、2.25%(n=7)，表明供试品溶液24 h内稳定。

2.3.5重复性试验 取同一批供试品(批号：20180526)内容物6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图及峰面积，按外标法计算10个成分含量及其RSD。结果马鞭草苷、虎杖苷、连翘苷、连翘酯苷A、芦荟大黄素、大黄素8-O-葡萄糖苷、大黄酸、甘草酸铵、大黄素、大黄酚平均质量分数分别为8.171、16.232、3.198、9.547、5.713、0.529、1.122、11.895、8.417、0.272 mg·g-1，RSD分别为0.74%、0.56%、0.28%、0.77%、0.92%、1.11%、0.78%、0.66%、0.49%、1.40% (n=6)，表明该方法重复性良好。

2.3.6加样回收率试验 精密称取2.3.5项下已知含量供试品9份，每份约0.5 g，分成3组，精密称定，分别加入含马鞭草苷(1.641 mg·g-1)、虎杖苷(3.245 mg·g-1)、连翘苷(0.638 mg·g-1)、连翘酯苷A(1.889 mg·g-1)、芦荟大黄素(1.141 mg·g-1)、大黄素8-O-葡萄糖苷(0.106 mg·g-1)、大黄酸(0.225 mg·g-1)、甘草酸铵(2.378 mg·g-1)、大黄素(1.681 mg·g-1)、大黄酚(0.054 mg·g-1)混合对照品溶液2.0、2.5、3.0 mL，按2.2.2项下方法处理，按2.1项下色谱条件进样分析，记录色谱图，计算10个化学成分加样回收率及相应RSD。结果马鞭草苷、虎杖苷、连翘苷、连翘酯苷A、芦荟大黄素、大黄素8-O-葡萄糖苷、大黄酸、甘草酸铵、大黄素、大黄酚平均加样回收率分别为104.37%、97.35%、100.50%、101.02%、102.42%、100.16%、104.27%、100.84%、98.14%、99.79%；RSD分别为0.40%、0.98%、0.41%、0.56%、0.83%、1.00%、0.58%、0.88%、0.91%、0.71% (n=9)。见表2。

表2 疏风解毒胶囊10个成分的加样回收率试验结果(n=9)

续表2

2.4 样品含量测定

取9批供试品，按照2.2.2项下条件处理，按2.1项下色谱条件平行进样3次，记录色谱图及相应峰面积，照外标法计算10个化学成分含量，结果见表3。

表3 疏风解毒胶囊10个成分含量测定结果(n=3) mg·g-1

3 讨论

3.1 质量评价指标成分的选择

疏风解毒胶囊中虎杖为君药，含有虎杖苷及蒽醌类成分大黄素、大黄酚等；连翘为臣药，含有木脂素类连翘苷和苯乙醇苷类连翘酯苷A、连翘酯苷E等；马鞭草为方中佐药，含有环烯醚萜类成分戟叶马鞭草苷和马鞭草苷；甘草为方中使药，含有甘草酸铵、甘草次酸及黄酮类成分甘草苷，笔者经UPLC多次实验分析，最终选择药效确切、性质稳定、色谱响应值高且分离效果好的马鞭草苷、虎杖苷、连翘苷、连翘酯苷A、芦荟大黄素、大黄素8-O-葡萄糖苷、大黄酸、甘草酸铵、大黄素、大黄酚10个化学成分做为质量研究指标。

3.2 色谱柱选择

本实验分别比较不同品牌UPLC色谱仪(Agilent 1290 Infinity型UPLC色谱仪、Waters ACQUITY UPLC系统)和色谱柱(Thermo SyncromisTMC18(100 mm×3.0 mm，1.7 μm)、ACQUITY UPLCTMC18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)、ZORBAX Eclipse plus C18(150 mm×2.1mm，1.8 μm)对10个化学成分含量结果的影响，结果各成分色谱峰分离度均符合规定，含量测定结果RSD均小于2.0%，方法耐用性良好。

3.3 供试品溶液制备方法选择

本实验对样品提取方法(超声30 min、回流2 h、索氏提取3 h)、提取溶剂(甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%乙醇、水)分别进行考察，超声不能完全提取出10种化学成分，且糖类等成分对分析结果影响较大，回流和索氏提取方法结果差异无统计学意义，但回流所需时间短、易于操作，故选择70%乙醇回流提取2 h作为供试品处理方法。

3.4 色谱条件选择

本研究考察流动相以甲醇、乙腈作为有机相，0.05%甲酸、0.05%磷酸、0.1%甲酸、0.2%甲酸作为水相，结果乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱时分离效果最佳，基线平稳，保留时间适中，各色谱峰峰形较好。

本研究采用二极管阵列检测器210～400 nm全波长扫描，结果显示，马鞭草苷、虎杖苷、连翘苷、连翘酯苷A、芦荟大黄素、大黄素8-O-葡萄糖苷、大黄酸、甘草酸铵、大黄素和大黄酚在250 nm处均有最大吸收，基线平稳、灵敏度高，故选择250 nm为检测波长。

4 结语

本研究建立UPLC同时测量疏风解毒胶囊中的马鞭草苷、虎杖苷、连翘苷、连翘酯苷A、芦荟大黄素、大黄素8-O-葡萄糖苷、大黄酸、甘草酸铵、大黄素、大黄酚10个成分的含量，与HPLC相比不仅增加检测指标、缩短分析时间、减少溶液消耗，极大降低分析成本，提高了检验效率[12]，且经精密度、稳定性、重复性、加样回收率等方法学考察均符合要求，结果准确、快速、可靠，可做为疏风解毒胶囊质量评价的有效方法。