桑不同药用部位总生物碱对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用△

李名洁，孙代华，王泽霞，胡辉，成焕波，陈志元

劲牌持正堂药业有限公司/湖北省中药配方颗粒工程技术研究中心，湖北 黄石 435100

糖尿病已成为严重危害人类健康的公共卫生问题，而我国是糖尿病患病率增长较快的国家之一。根据国际糖尿病联盟统计结果，2019年世界上约有4.63亿糖尿病患者，预计到2045年将增长51%左右，其中90%为2型糖尿病患者[1]。长期高血糖可能导致失明、肾功能衰竭、心血管疾病等，因此，糖尿病已成为致死率排名第4的疾病[2]。有效控制餐后血糖上升有利于防治糖尿病及其并发症的发生。α-葡萄糖苷酶为碳水化合物消化的关键酶，是控制餐后血糖的关键靶标。α-葡萄糖苷酶抑制剂是一种新兴的口服降血糖药，能竞争性抑制α-葡萄糖苷酶的活性，延缓或抑制葡萄糖在肠道中的吸收，该类药物在临床上主要用于2型糖尿病的治疗。临床上常用的药物有阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等，具有良好的餐后降血糖作用，但是长期服用会引起胀气、腹部不适等不良反应，还有可能产生药物耐药性[3]，因此，探求温和、不良反应较少、功效稳定的降血糖药物一直是亟待解决的问题。

桑MorusalbaL.为桑科桑属落叶乔木或灌木。中国是桑蚕产业的发祥地，已有5000多年的历史，目前是桑树种植面积最大的国家之一，拥有丰富的桑树资源。桑树除了养蚕制丝外，也是传统中药材，主要以桑叶、桑枝、桑白皮作为中药药材。桑叶是桑科植物桑树的叶子，是一类药食同源的植物资源。《本草纲目》中记载：“桑叶乃手足阳明之药，汁煎代茗，能止消渴，明目长发”[4]2067-2068。桑枝主要指桑树的一年生枝条，其作为降血糖药用在《本草图经》也有记载：“桑枝疗遍体风痒干燥，兼疗口干”[5]。桑白皮是桑除去栓皮的干燥根皮，其中《本草纲目》记载：“桑白皮主治消渴尿多”[4]2069。可见桑叶、桑枝、桑白皮在治疗糖尿病方面应用较多，现代药理学研究表明，桑叶、桑枝、桑白皮富含生物碱、多糖、黄酮类化合物，其中以1-脱氧野尻霉素(DNJ)为代表的生物碱类化合物是发挥降血糖作用的主要成分，降糖机制为通过抑制α-葡萄糖苷酶活性，从而抑制肠道对糖的吸收，减少食后血糖的高峰值[6]。为了比较桑不同药用部位生物碱中DNJ含量及其在降血糖方面的药效作用，本研究采用水提、离子树脂富集纯化制备桑叶、桑枝、桑白皮总生物碱，采用蒸发光散射检测器(ELSD)-高效液相色谱法(HPLC)检测总生物碱中DNJ含量并评价其对α-葡萄糖苷酶抑制活性，为提高桑资源附加值及扩大桑资源的综合利用提供参考。

1 材料

1.1 试药

桑叶(批号：1908100)、桑枝(批号：1812078)、桑白皮(批号：1805083)均购于安徽豪药千草国药股份有限公司，经湖北中医药大学刘义梅教授鉴定分别为桑科植物桑MorusalbaL.的叶、枝条、除去栓皮的根皮；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG，批号：N1337-1G)、α-葡萄糖苷酶(批号：G5003-100UN)均购于Sigma公司；阿卡波糖(批号：A129816，纯度>99.9%)购于阿拉丁试剂有限公司；对照品DNJ(批号：112008-201801，纯度>97.7%)购于中国食品药品检定研究院；其他所有试剂均为商用分析纯。

1.2 仪器

BioTek Synergy 2型多功能酶标仪(Gene Company Limited基因有限公司)；BSD-TX318型台式恒温振荡器(上海搏讯仪器有限公司)；1200型高效液相色谱仪(包括G1311A型四元梯度泵、G1329B型自动进样器、G1316A型柱温箱、ELSD，安捷伦有限公司)；PURELAB Ultra型纯水机(威立雅水务公司)；XSR105DU型电子天平(梅特勒-托利多公司)。

2 方法与结果

2.1 桑不同药用部位总生物碱制备

分别称取适量的桑枝、桑白皮、桑叶，使用植物粉碎机粉碎，过40目筛，各取1000 g，分别用5 L纯化水加热回流提取2 h，重复提取2次，合并提取液，滤过，合并滤液，浓缩至固含量为10%后，滤过，滤液上LSI-010型阳离子交换树脂(氢型)，水洗至中性后，用0.5 mol·L-1氨水洗脱，收集洗脱液后浓缩，上D941型阴离子交换树脂(氢氧型)，收集不吸附部分浓缩干燥，分别得桑枝总生物碱1.5 g、桑叶总生物碱4.2 g、桑白皮总生物碱3.4 g。

2.2 溶液配制

2.2.1DNJ对照品溶液 精密称取对照品DNJ 10.58 mg，置于25 mL量瓶中，用乙腈-水(50∶50，水中含6.5 mmol·L-1乙酸铵)溶解并定容至刻度，作为对照品储备液，其中DNJ质量浓度为423.2 mg·L-1。分别精密吸取配制的对照品储备液2、4、6、8 mL于10 mL量瓶中，用乙腈-水(50∶50，水中含6.5 mmol·L-1乙酸铵)稀释并定容至刻度，得到DNJ质量浓度分别为84.39、168.8、253.2、337.5 mg·L-1的稀释液，取对照品储备溶液和上述稀释液用0.22 μm有机相微孔滤膜滤过，得系列质量浓度的DNJ对照品溶液。

2.2.2阿卡波糖溶液 精密称取阿卡波糖14.18 mg，加0.05 mol·L-1磷酸钾缓冲液溶液(pH 6.8)溶解并稀释，制得质量浓度为400.000、100.000、25.000、6.250、1.563 mg·L-1的阿卡波糖对照品稀释溶液。

2.2.3供试品溶液-1(用于测定DNJ含量) 精密称取桑枝总生物碱、桑叶总生物碱、桑白皮总生物碱各12.32、10.36、10.51 mg，分别置于10 mL量瓶中，用乙腈-水(50∶50，水中含6.5 mmol·L-1乙酸铵)溶解并定容至刻度，作为桑枝总生物碱供试品溶液-1、桑叶总生物碱供试品溶液-1、桑白皮总生物碱供试品溶液-1。

2.2.4供试品溶液-2(用于测定α-葡萄糖苷酶抑制活性) 称取一定量的桑枝、桑叶、桑白皮总生物碱，分别置于10 mL量瓶中，加入0.05 mol·L-1磷酸钾缓冲液溶液(pH 6.8)溶解并稀释，制得质量浓度为400.000、100.000、25.000、6.250、1.563 mg·L-1的桑枝生物碱供试品溶液-2、桑叶生物碱供试品溶液-2、桑白皮生物碱供试品溶液-2。

2.3 桑不同部位总生物碱中DNJ含量测定

2.3.1色谱条件 参照文献报道方法[7]，经过优化后，得出以下色谱条件：Shodex Asahipak NH2P-50色谱柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；ELSD漂移管温度：100 ℃；氮气流速：2.5 L·min-1；流动相：乙腈-水(82∶18，水中含6.5 mmol·L-1乙酸铵)；等度洗脱，流动相流速为1.0 mL·min-1。

2.3.2方法学考察 取样品溶液重复进样6次，以DNJ峰面积为指标计算RSD(n=6)，考察方法精密度；样品溶液间隔0、1、2、4，6、12 h进样分析，以DNJ峰面积为指标计算RSD(n=6)，考察样品的稳定性；在已知DNJ含量的样品溶液中加入对照品溶液，考察方法的平均回收率(n=6)[7]。结果表明，DNJ的精密度RSD为1.64%，稳定性RSD为0.68%，平均回收率为100.6%，加标回收率的RSD为1.27%，均符合分析要求。

2.3.3线性范围 精密吸取2.2.1项下配制的DNJ对照品溶液2 μL，按2.3.1项下色谱条件进样分析。以峰面积为纵坐标(Y)、质量浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，方程为Y=0.563 6X-1.163(r=0.999 7)。结果表明，DNJ质量浓度在84.64～423.3 mg·L-1呈良好线性关系。

2.3.4DNJ含量测定 在上述色谱条件下，精密吸取2.2.3项配制的桑叶、桑枝、桑白皮总生物碱供试品溶液-1各2 μL，按上述色谱条件进样分析，测得样品的峰面积，代入到标准曲线中计算出样品溶液中的DNJ质量浓度。结果显示，桑不同药用部位总生物碱中DNJ质量分数为桑白皮生物碱(30.1%)>桑枝生物碱(25.8%)>桑叶生物碱(21.4%)。

2.4 桑不同药用部位总生物碱酶抑制实验

2.4.1分组及处理 参考文献方法[8]，并在此基础上经过优化，以阿卡波糖为对照，pNPG为底物，测定样品对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

本实验在96微孔板中测定完成，设空白组(样品+底物)、对照组(酶液+底物)、阳性对照组(阿卡波糖+酶液+底物)及桑不同部位总生物碱样品组(供试品溶液-2+酶液+底物)，每组3个重复。空白组加入磷酸钾缓冲液(0.05 mol·L-1，pH 6.8)60 μL和各供试品溶液-2 20 μL。对照组加入磷酸钾缓冲液(0.05 mol·L-1，pH 6.8)80 μL和α-葡萄糖苷酶(0.2 U·mL-1，用0.05 mol·L-1pH 6.8的磷酸钾缓冲液溶解)20 μL。各样品组加入磷酸钾缓冲液(0.05 mol·L-1，pH 6.8)60 μL、供试品溶液-2 20 μL和α-葡萄糖苷酶(0.2 U·mL-1，用0.05 mol·L-1pH 6.8的磷酸钾缓冲液溶解)20 μL。阳性对照组用阿卡波糖溶液替代样品组中供试品溶液-2，反应体系中其他条件不变。各组溶液振荡混匀后，37 ℃恒温孵育20 min，加入2.0 mmol·L-1的pNPG 20 μL，振荡混匀，在37 ℃恒温反应30 min后，加入2 mol·L-1碳酸钠水溶液150 μL终止反应。

反应终止后于405 nm测定吸光度(A)值，抑制剂对α-葡萄糖苷酶的抑制率按公式(1)计算。

抑制率={[(A对照-A空白)-(A样品-A空白)]/(A对照-A空白)}×100%

(1)

不同质量浓度的桑药用部位总生物碱及阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制作用结果见图1，可以看出桑枝、桑叶、桑白皮总生物碱均表现出较强的酶抑制活性，随着质量浓度的增加，对α-葡萄糖苷酶抑制作用逐渐增强。在质量浓度均为100.0 mg·L-1时，桑枝总生物碱的抑制率最高，桑白皮总生物碱的抑制率最低，但均高于阿卡波糖抑制率。

图1 桑不同药用部位总生物碱及阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制活性

由图1得到桑不同药用部位总生物碱对α-葡萄糖苷酶最大半数抑制浓度(IC50)。桑枝、桑叶、桑白皮总生物碱及阿卡波糖的IC50依次为2.257、5.525、6.345、60.51 mg·L-1。结果表明，桑不同药用部位所制备的总生物碱中，桑枝、桑叶、桑白皮总生物碱对α-葡萄糖苷酶的抑制活性均优于阿卡波糖，其中桑枝总生物碱抑制活性最强。

3 讨论与结论

Asano等[9]报道了桑不同药用部位均有较强的降血糖活性，其所含的生物碱类化合物大部分是多羟基哌啶化合物，其降血糖活性显著，主要代表物质为DNJ，通过抑制α-糖苷酶活性降低餐后血糖。DNJ的化学名称为(2R，3R，4R，5S)-2-羟甲基-3，4，5-三羟基哌啶，最先从链霉菌中分离得到，随后研究表明，DNJ也存在于桑树的枝、叶、皮中，并且发现DNJ在桑不同部位中分布差异性较大[10]。研究者制备了桑枝、桑叶和桑白皮药材水提物和醇提物，发现桑不同药用部位制备的水提物及醇提物降血糖活性差别较大[10-11]。

本研究采用水提、离子树脂富集纯化等方法分别制备了桑叶、桑枝、桑白皮总生物碱，采用ELSD-HPLC测定其DNJ含量，最后以IC50为评价指标，阿卡波糖为阳性对照药，以pNPG为底物，采用体外抑制模型方法评价桑不同药用部位总生物碱对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。结果显示，桑不同药用部位总生物碱中DNJ含量大小为桑白皮总生物碱>桑枝总生物碱>桑叶总生物碱，但是桑不同药用部位总生物碱对α-葡萄糖苷酶抑制作用强度为桑枝总生物碱>桑叶总生物碱>桑白皮总生物碱。从实验结果可知，通过水提、离子树脂富集纯化等方法制备的桑叶总生物碱、桑枝总生物碱、桑白皮总生物碱的酶抑制活性与其所含的DNJ含量不呈正相关。

本研究结果表明，桑不同药用部位(桑枝、桑叶、桑白皮)总生物碱在开发成辅助降血糖的保健食品或药品方面具有良好的潜力，但是桑不同药用部位(桑枝、桑叶、桑白皮)总生物碱成分复杂，发挥功效的主要成分是否为DNJ以及不同生物碱类成分是否具有协同作用或者拮抗作用均有待进一步研究。下一步可对桑不同药用部位(桑枝、桑叶、桑白皮)总生物碱进行活性跟踪筛选，分离、纯化出对α-葡萄糖苷酶产生抑制作用的主要单体成分，并对其各个成分协同作用或者拮抗作用机制进行研究。