滇黄精种子质量检验方法△

李云，苏钛，李玛，熊永兴，，邱斌，，3*

1.云南白药集团中药资源有限公司，云南 昆明 650500；2.云南省药物研究所，云南 昆明 650111；3.云南中医药大学，云南 昆明 650500

滇黄精PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.首载于《滇南本草》，为百合科(Liliaceae)黄精属(Polygonatum)多年生草本植物，主要分布于我国云南、四川和贵州，越南、缅甸也有分布[1]。其以干燥根茎入药，收载于历版《中华人民共和国药典》，是云南省重要的道地药材之一，具补气养阴、健脾、润肺、益肾之功效，用于脾胃气虚、体倦乏力、胃阴不足、口干食少等[2]。目前，滇黄精药材主要来源于野生，由于过度采挖，资源已近枯竭。滇黄精繁殖方式分为有性和无性2种，早期生产栽培上主要采用块茎无性繁殖的方式，出苗率低且种苗整齐度差，其产量和质量已不能满足市场需求。采用有性繁殖时，因滇黄精种子胚后熟且具有休眠特性，自然条件下30 d萌发率仅为32%，60 d萌发率不足80%，整齐度低，对规范化种植造成了较大影响[3]。因此，建立滇黄精种子质量标准检验方法，保证种子质量，对人工规模化、标准化种植具有重要意义。

目前，滇黄精的研究主要集中在资源、化学、药理等方面[4-11]，关于滇黄精种子检验规程的研究尚属空白。本研究参照《农作物种子检验规程》GB/T 3543.2—1995，对滇黄精种子真实性鉴定、净度、千粒质量、含水量、发芽率等主要指标开展了系统的研究，初步建立了滇黄精种子质量检验方法，为制定滇黄精种子检验规程及质量分级标准提供参考。

1 材料

2017年11月于云南省文山、普洱、昭通、曲靖等地采集种子样品(表1)，经云南省药物研究所中药材种植研究室邱斌正高级工程师鉴定为滇黄精PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.的种子。

表1 滇黄精种子信息

赤霉素(GA3，生化试剂，国药集团化学试剂有限公司)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。MGC-450HP型光照培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

2 方法

2.1 扦样

依据滇黄精种子市场流通情况和单次可能的交易量，参照《农作物种子检验规程》 GB/T 3543.2—1995扦样方法执行，净度分析试验样品≥200 g，种子及送验样品为试验样品10倍量。采用徒手减半法分取初次样品和实验样品。

2.2 净度分析

参照《农作物种子检验规程》GB/T 3543.2—1995净度分析规定进行净度分析。随机称取(50.00±0.05) g，5次重复。

2.3 真实性鉴定

采用外观形态观察法和外观形态测量法，用肉眼观察滇黄精种子形态并对其进行形态形状描述；用电子数显卡尺(0～150 mm)对其粒长、粒宽(直径)进行测量，记录数据。随机选取滇黄精种子样品50粒，3次重复。

2.4 千粒质量测定

取净选后的种子分别采用百粒法、千粒法测定种子质量。

百粒法：随机从净种子中数取100粒，重复6次，分别记录百粒质量，计算标准差及变异系数，变异系数<4%则该测定值有效。

千粒法：随机从净种子中取1000粒，重复 2次，分别记录千粒质量，计算重复间差数与平均数之比，重复间差数与平均数之比<5%则该测定值有效。

2.5 含水量测定

取净选后的种子，参照《农作物种子检验规程》GB/T 3543.6—1995水分测定的规定，分别采用高温[(133±2) ℃]恒温烘干法与低温[(105±2) ℃]恒温烘干法进行含水量测定。每份试样称取种子样品5 g，重复3次。低恒温烘干法要求每隔1 h 测定质量；高恒温烘干法要求每隔30 min测定质量，至连续3次相对偏差<3 mg。

2.6 生活力测定

2.6.1染色温度和染色时间确定 净选后随机选取30粒种子，常温条件下用蒸馏水浸泡48 h后沿种子胚轴纵切，带胚的一半放入培养皿进行测试。倒入0.03%TTC溶液，放置于20、25、30、35 ℃的避光恒温培养箱中，观察不同时间滇黄精种子样品的染色情况并记录。

2.6.2TTC质量分数确定 净选后随机选取30粒种子，在常温条件下用蒸馏水浸泡48 h后沿种子胚轴纵切，带胚的一半放入培养皿进行测试。倒入0.01%、0.03%、0.05%、0.07%TCC溶液浸湿，放置于避光恒温培养箱中，温度设定为2.6.1项下确定的最佳温度，观察经过不同质量分数TTC溶液处理的滇黄精种子样品染色情况并记录。

2.6.3有无生活力鉴定标准的确定 观察滇黄精种子有无生活力。有活力的种子胚染色后为鲜红色或浅红色，种子切面全部着色或大部分着色，染色均匀；无生活力者，胚完全不着色或着浅色，染色不均匀或局部着色，着色较浅。

2.7 发芽率测定

2.7.1发芽前处理 采用以下方法对种子进行前处理：1)层积实验：滇黄精种子于4 ℃下湿砂层积60 d；2)外源激素实验：150 mg·L-1GA3浸种24 h；3)层积+外源激素实验：滇黄精层积60 d 后，再用150 mg·L-1GA3浸种24 h；4)CK：未经任何处理的种子直接用于发芽实验。用双层滤纸作发芽床，25 ℃、黑暗条件下的培养箱中培养。每个处理100粒种子，3次重复。

2.7.2发芽床的选择 设置砂上、纸上和砂间3个处理，培养条件为20 ℃黑暗培养，每个处理100粒种子，3次重复，观察统计种子发芽情况。

2.7.3发芽温度和光照的选择 设置15、20、25、30 ℃ 4个处理，发芽床为纸上，光照12 h·d-1和黑暗处理。每个处理100粒种子，3次重复，观察种子发芽情况。

2.7.4发芽计数时间确定 根据滇黄精种子发芽表现，明确初次计数时间和末次计数时间。初次计数时间为胚根伸出种皮2 mm，末次计数时间为种子发芽数达到最高时，以后再无发芽种子出现时的天数为准。

2.7.5结果统计 试验结果以发芽率表示，按公式(1)计算发芽率。

发芽率=实验结束时发芽的种子数/供试种子数×100%

(1)

3 结果

3.1 扦样

采用徒手四分法，滇黄精种子的净度分析实验所需样品应≥200 g，送检样品应≥2000 g。

3.2 净度分析

如表2所示，滇黄精种子净度较高，在97.84%以上，各试样增失差距均在原始质量的5%以内，故此方法和程序可行。

表2 滇黄精种子净度

3.3 真实性鉴定

滇黄精种子呈椭圆球形，新鲜滇黄精种子表面淡黄白色，微扁状，表面光泽，质硬。干燥后种子呈黄褐色，种子坚硬，种脐明显，呈深褐色，圆点状。整个种子种皮1层，粒长4.69～7.40 mm，粒宽3.23～5.43 mm。

3.4 千粒质量

百粒法测定的滇黄精种子的变异系数为2.6%，小于标准值4.0%，因此测定值有效；千粒法测定滇黄精种子之后的重复间差数与平均数之比为4.1%，小于标准值5.0%，因此测定值有效(表3)。综合比较2种方法，百粒法所需种子量少，故确定百粒法为滇黄精种子质量测定方法，千粒质量为83.3～85.3 g。

表3 滇黄精种子质量测定结果

3.5 含水量测定

采用高恒温烘干法[(133±2) ℃]测定滇黄精种子样品的含水量，滇黄精种子在烘干过程中前4 h内失水迅速，之后的几个小时失水缓慢。7 h后接近恒重，种子的含水量也逐渐趋于稳定，3次测量后的相对偏差在3 mg以下。采用低恒温烘干法[(102±2) ℃]测定滇黄精种子样品的含水量可知，种子在烘干过程中前8 h内失水迅速，至11 h后接近恒重，种子的含水量也逐渐趋于稳定。2种方法相比较，高恒温烘干法比较节约时间，故选用高恒温烘干法烘干7 h 测定滇黄精种子含水量。滇黄精种子含水量为34.8%～35.9%。

3.6 生活力测定

3.6.1染色温度和染色时间确定 不同温度、时间对滇黄精染色影响较大，在同一温度下，染色率与时间成正比；在同一染色时间里，染色率随着温度的上升逐渐升高，在35 ℃达到顶峰，而后出现下降趋势。在同一染色温度下，24 h内染色率与时间成正比，24 h以后无明显上升趋势(表4)。故滇黄精的适宜染色温度为35 ℃，染色时间为24 h。

表4 染色温度和时间对滇黄精种子生活力的影响

3.6.2TTC质量分数确定 TTC质量分数为0.01%～0.07%时，染色率呈先上升而后逐渐下降趋势(表5)。在质量分数为0.03%时，滇黄精种子生活力测定值最高。因此，TTC染色法测定滇黄精种子的生活力最适宜质量分数为0.03%。该条件下测定DHJ-1、DHJ-2、DHJ-3、DHJ-4、DHJ-5的生活力分别是98.6%、96.7%、99.2%、95.9%、96.3%。

表5 TTC质量分数对滇黄精种子染色率的影响

3.7 发芽率测定

3.7.1发芽前处理 以盐津县牛寨乡的滇黄精种子为实验对象。滇黄精种子经层积处理后能明显减少发芽时间数，提高发芽率和发芽势(表6)。层积处理后，时间从CK 处理的21 d减少至12 d，发芽势从25.8%提升至5.6%。GA3处理与CK 无明显区别。层积+GA3 处理能大幅减少发芽天数，6 d便能萌发，发芽势与层积处理无明显差别。故萌发前处理优势为层积+GA3>层积>CK>GA3。滇黄精种子萌发前处理宜用层积60 d 后，用150 mg·L-1的GA3浸泡24 h。

表6 前处理对滇黄精种子萌发的影响

3.7.2发芽床的选择 发芽床对滇黄精的发芽影响较小。纸上和砂上发芽率大致相当，略高于砂间(表7)。故滇黄精种子适宜的发芽床为纸上和砂上，鉴于实验操作的便捷，选择纸上作为发芽床。

表7 不同发芽床滇黄精种子发芽率

3.7.3发芽温度和光照的选择 滇黄精种子的萌发随着温度的提高出现先上升后下降的趋势(表8)。在15～25 ℃，滇黄精种子萌发率逐渐上升，30 ℃后明显下降。光照对滇黄精种子萌发影响显著。黑暗条件下明显高于12 h 光照。故滇黄精种子适宜萌发条件为温度为20～25 ℃，避光环境下。

表8 不同温度和光照下滇黄精种子发芽率

3.7.4发芽计数时间的确定 种子置发芽床后第六天胚根突破种皮约2 mm，以后种子逐渐发芽，27 d后，发芽基本结束。因此，滇黄精种子初次计数时间为第六天，末次计数时间为第二十七天。

3.8 滇黄精种子检验规程的制定

参照《农作物种子检验规程》，从扦样、净度分析、真实性鉴定、质量测定、发芽条件探索、含水量及生活力测定7个方面进行滇黄精种子质量检验方法进行系统研究，初步确定适宜滇黄精种子质量指标的检验方法(表9)。

表9 滇黄精种子质量检验方法

4 讨论

中药材种子质量研究起步晚，其研究以农作物种子检验为圭臬，对市场流通的中药材种子无法有效控制。随着医药现代化的进程，三七、人参[12]等已走出国门，发布了种子国际标准，对中药材种子市场的规范起到了引领作用。种子作为药材质量的源头，是决定药材品质的关键因素，种子质量研究为药材质量的第一道关卡。本研究参照《农作物种子检验规程》，从扦样、净度分析、真实性鉴定、千粒质量、含水量、发芽及生活力7个方面对滇黄精种子质量检验方法进行研究，初步确定了适宜滇黄精种子质量指标的检验方法。

滇黄精系云南道地药材，分布区域较广。本研究针对云南“一山分四季，十里不同天”的低纬高原地域特性，从滇黄精主要分布区域，选取5个主产区作为代表，能较好地反映生产用种质量。

黄精种子具有休眠特性[13-14]，采用低温层积和激素处理可以打破休眠，提前萌发。本研究所用种子为新鲜种子(新鲜果实经塑料袋密封20 d后，搓去种皮)，通过层积60 d和GA3浸泡24 h可促进胚的后熟，解除胚的休眠，缩短发芽天数，提高发芽率和发芽势。