外源硒对镉胁迫下紫苏幼苗生长发育毒害的缓解效应

李 颖，杨小环，鲁一薇，马金虎

（1.山西农业大学农学院，山西太谷030801；2.山西农业大学社会服务部，山西太谷030801）

镉（Cd）是生物毒性最大的重金属之一，过量的镉会抑制种子萌发和植物生长，降低叶绿素产量并抑制光合作用，破坏细胞膜结构，降低植物的抗氧化能力，造成作物减产[1-3]；更严重的是，土壤中的镉通过植物根系富集，经食物链传递进入人体，从而危害人体健康[4]。近年来，由于工业生产、农业施肥及污水灌溉等人为因素致使土壤中镉含量升高[5]。如何缓解镉对植物的毒害，受到人们的广泛关注。

硒是一种对植物生长发育有益的微量元素[6-7]，是谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的组成成分和活性中心，含硒的GSH-Px 可以催化过氧化物分解，清除植株体内自由基，保护细胞和细胞膜免受氧化损伤[8-9]。众多研究表明，硒参与调控植物呼吸作用和光合作用、提高抗逆性、抵御植物体内自由基的伤害，缓解重金属的毒害作用[10-12]。郁飞燕等[13]研究发现，通过对水稻幼苗施加一定浓度的硒，可以缓解镉胁迫对水稻幼苗生物量的抑制作用，并显著提高叶绿素含量。吕选忠等[14]研究发现，叶面喷硒可降低生菜对镉的吸收，植物体内的硒可诱导谷胱甘肽过氧化物酶活性，进而影响整个酶的保护系统。饶玲等[15]研究发现，适量蛋氨酸硒（SeMet）的施用能显著提高干旱条件下黄瓜幼苗叶片抗氧化酶（SOD、POD、APX）活性，而使其叶片中MDA 含量、O2·-的产生速率和H2O2含量显著降低。王立新等[16]研究发现，硒可使植物体内H2O2水平、膜脂质过氧化程度降低，平衡植物体内活性氧的清除和生成，使幼苗的生理机能得到提高，增加植株的抗镉胁迫能力。目前，国内外硒缓解植物中镉胁迫的研究主要集中在大麦[17]、水稻[18]、油菜[19]等植物。

紫苏（Perilla frutescens）是唇形科1 年生草本植物，不仅是旱薄地的优势作物，而且作为药食两用的油料作物，具有护肝降压、提高免疫力等功效。研究发现，紫苏具有重金属富集作用[20-21]，而在紫苏上硒缓解镉毒害作用与机制的研究鲜有报道。

本试验采用紫苏水培的方法，研究喷施不同浓度的硒缓解镉胁迫对紫苏早期幼苗的伤害，旨在减轻土壤中的镉污染对紫苏的毒害作用，为种植富硒紫苏提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试紫苏为2017 年绿色品种（ZB1）白苏种子，由中北大学提供。供试硒源为分析纯亚硒酸钠（Na2SeO3），购于Sigma 公司；镉源氯化镉（CdCl2），购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 材料培养与处理 挑选均匀饱满、无破损优质的紫苏种子适量，0.1%HgCl2消毒10 min，去离子水冲洗3～5 次，用滤纸吸干种子表面水分；取适量种子置于培养皿中，在25 ℃黑暗条件下恒温培养箱中催芽，挑选发芽一致的种子移至水培盒，置于25 ℃/22 ℃（昼/夜），16 h/8 h（光/暗）培养5 d，依次转移至1/8 和1/4 体积的Hoagland and Snyde（1938）通用配方营养液[22]中各培养5 d；然后将幼苗分成7 组，每组3 盒，再用1/4 体积的Hoagland 营养液培养2 d 后处理。

根据前期预试验，设置含2 μmol/L CdCl2营养液水培胁迫，同时叶面喷施不同浓度的Na2SeO3水溶液，共设7 个处理：CK.1/4 营养液；T1.2 μmol/L CdCl2；T2.0.25 μmol/L Na2SeO3＋2 μmol/L CdCl2；T3.0.5 μmol/L Na2SeO3＋2 μmol/L CdCl2；T4. 1 μmol/L Na2SeO3＋2 μmol/L CdCl2；T5. 2 μmol/L Na2SeO3＋2 μmol/L CdCl2；T6. 4 μmol/L Na2SeO3＋2 μmol/L CdCl2。每隔1 d 喷施一次Na2SeO3溶液，3 d 更换一次营养液。待幼苗出现表型差异时（处理14 d），进行各指标统计分析。

1.2.2 生物量测定 试验处理结束后，每个处理随机选取10 株植株，株高的测定从子叶节点到生长点为基准，然后将幼苗用蒸馏水清洗2 次，用吸水纸吸干表面水分，分别测定植株地上和根部鲜质量并记录，随后将其分别放入密封袋内，在80 ℃下烘干至恒质量，称质量并记录。

1.2.3 叶绿素含量测定 叶绿素含量的测定参照明东风[23]的方法并加以改进。每个处理随机选取5 株完全展开的紫苏第2 片叶用蒸馏水清洗2 遍，称取0.1 g 放入25 mL 玻璃管中，同时加入20 mL 96%乙醇，在黑暗条件下放置至叶片完全变白后，摇匀。用紫外分光光度计（UV-2450，SHIMADZU，Japan）在470、649、665 nm 波长下测定叶绿素提取液的吸光值（以不加叶片的空白提取液调零）。

1.2.4 光合指标测定 采用美国LI-COR 公司的LI-6800 便携式光合测定系统在9：00—11：00 测定叶片的净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间CO2浓度（Ci）和蒸腾速率（Tr）。测定时设定光合强度（PAR）为300 μmol/（m2·s），相对湿度（RH）为50%，温度为25 ℃。

1.2.5 抗氧化酶活性测定 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用氮蓝四唑法，过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚法，过氧化氢酶（CAT）活性测定采用H2O2紫外吸收法，丙二醛（MDA）含量测定采用硫代巴比妥酸法[24]，超氧阴离子（O2·-）自由基含量测定参照李忠光等[25]的方法进行。

1.2.6 渗透调节物质测定 可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250 染色法[24]。

1.3 数据分析

所有数据的统计分析均采用SPSS 20.0 软件处理，采用Duncan 新复极差测验法进行数据差异显著性检验（P＜0.05），利用Excel 2003 软件作图。

2 结果与分析

2.1 叶面喷硒对镉胁迫下紫苏幼苗生长的影响

从表1 可以看出，镉胁迫（T1）显著抑制紫苏幼苗的生长，与CK 相比，地上部鲜质量、地上部干质量、根部鲜质量、根部干质量和株高分别降低了24.1%、27.9%、37.1%、30.0%和18.6%，且均达显著水平；叶面喷施不同浓度的硒，可不同程度缓解镉对紫苏幼苗生长的伤害。叶面喷施1 μmol/L 硒溶液（T4）时生物量达到最大，与T1 处理相比，其地上鲜质量、地上干质量、根部鲜质量、根部干质量和株高分别升高了31.8%、29.0%、46.8%、28.6%和17.3%。

表1 叶面喷硒对镉胁迫下紫苏幼苗生长的影响

2.2 叶面喷施硒对镉胁迫下紫苏幼苗光合特性的 影响

由图1 可知，与CK 相比，T1 处理的叶绿a、叶绿素b、类胡萝卜素和叶绿素总含量分别显著降低了51.2%、55.4%、37.8%和52.2%；镉胁迫下，叶面喷施硒溶液处理的紫苏幼苗叶绿素含量始终高于T1 处理，且随着硒溶液浓度的升高均呈现先升高后降低的变化趋势，当浓度为1 μmol/L（T4）时，叶绿素含量最高，比T1 处理显著提高了105.5%；T2、T3、T5 和T6 处理的叶绿素含量分别比T1 处理显著提高了47.38%、67.9%、27.5%和8.1%。

由图2 可知，与CK 相比，镉胁迫（T1）处理使紫苏幼苗的净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）分别显著降低了46.4%、41.7%、52.1%，胞间CO2浓度（Ci）显著提高了10.3%；喷施硒可不同程度提高紫苏幼苗的Pn、Tr、Gs，但均未恢复到胁迫前水平，同时降低了Ci；当硒浓度为1 μmol/L（T4）时，Pn 最高，比T1 处理显著提高了55.2%；当硒浓度为0.5 μmol/L（T3）时，Tr 和Gs 均最高，分别比T1处理提高了28.6%、27.6%，但与T1 处理间差异不显著；不同浓度硒处理的Ci 差异不显著。可见，外源硒可以缓解镉胁迫对紫苏光合作用的抑制。

2.3 叶面喷施硒对镉胁迫下紫苏幼苗抗氧化水平的影响

由图3 可知，镉胁迫处理（T1）比CK 显著提高了紫苏幼苗叶片和根系抗氧化酶SOD、POD 和CAT 活性，其中，叶片中分别提高了30.2%、290.2%和37.5%，根系中分别提高了68.2%、241.7%和185.9%；不同硒浓度均可降低紫苏叶片与根系的SOD、POD、CAT 活性，与T1 处理相比，紫苏幼苗叶片与根系的抗氧化酶活性随硒浓度的升高呈现先降低后升高的变化趋势，当硒浓度为1 μmol/L（T4）时，抗氧化酶活性最低，其中，叶片的SOD、POD 和CAT 活性分别比T1 处理降低了13.5%、58.7%和36.1%，根中分别降低了26.3%、49.4%和23.8%。值得注意的是，除叶片中CAT 活性恢复到胁迫前水平外，其余均未恢复到胁迫前水平。此外，叶中和根中各处理间SOD 活性差异不显著，而POD 活性差异显著；叶中CAT 活性在T4 处理显著降低，而根中的CAT 活性在低浓度硒处理间差异不显著。

植物体内活性氧（ROS）在正常代谢时维持在一个动态平衡的状态，当植物收到外界环境胁迫时，超氧阴离子（O2·-）会大量积累，诱发细胞膜发生膜脂过氧化反应，破坏膜的完整性，同时产生大量的MDA。从图3 可以看出，镉胁迫处理（T1）显著提高了紫苏幼苗叶片和根系的O2·-和MDA 含量，其中，叶片中O2·-和MDA 含量分别比CK 显著提高了60.2%和39.6%，根中分别提高了459.6%和144.4%；外施硒可降低紫苏幼苗O2·-和MDA 含量，随着硒溶液浓度的升高均呈现先降低后升高的趋势，且在硒溶液浓度为1 μmol/L（T4）时，O2·-和MDA 含量均达到最低，其中，叶片中O2·-和MDA 含量分别比T1 处理显著降低了44.1%和22.9%，根中O2·-和MDA 含量分别显著降低了60.1%和45.5%。值得注意的是，叶片中O2·-和MDA 含量可恢复到胁迫前水平，而根中不能恢复到胁迫前水平。

2.4 叶面喷施硒对镉胁迫下紫苏幼苗可溶性蛋白含量的影响

由图4 可知，与CK 相比，镉胁迫处理一定程度上降低了紫苏幼苗叶片、根系的可溶性蛋白含量，分别下降了26.7%和47.2%。与镉胁迫处理相比，叶面喷施不同浓度硒可不同程度提高紫苏叶片、根的可溶性蛋白含量，但各处理间未达显著水平，其中，T4 处理的可溶性蛋白含量最高，分别比T1 处理提高了24.3%和95.1%。

3 结论与讨论

镉作为一种具有强烈毒性的重金属元素，在植物幼苗生长过程中，会对植物产生毒害作用，损伤根部，抑制水分吸收，阻碍植物的光合作用和蒸腾作用，使植物表现出褪色、矮化、生长延迟等症状，造成植物的生物量下降，严重时甚至死亡[26]。已有研究证实，硒可有效缓解镉胁迫对植物造成的毒害[10-12]。本试验中，镉胁迫后喷施不同浓度硒，紫苏幼苗的干鲜质量、株高均呈现先升高后降低的趋势，叶片中叶绿素含量也呈现相同的变化趋势。说明硒参与了镉胁迫下紫苏幼苗的防御反应，从而提高了幼苗耐镉的能力，促进早期幼苗生长，但高浓度的硒会对植物产生伤害。这与孙红艳等[27]的研究结果一致。研究发现，镉胁迫引起植物叶片Pn 降低有2 种原因，即气孔因素和非气孔因素，当Ci 和Gs 同时下降时，气孔因素是主要的；当Ci 升高而Gs 下降时，非气孔因素是主要的[28]。本试验中，镉胁迫降低了紫苏叶片的Pn，同时使紫苏叶片的Ci 升高、Gs 降低，可以推断紫苏光合速率下降的主要原因是非气孔因素。

在植物的抗氧化系统中，SOD 是第一道防线，它能将植物体内的O2·-等活性氧转化成H2O2，再经由POD、CAT 等将H2O2进一步转化为O2和H2O，从而有效地阻止O2·-和H2O2相互作用对细胞膜产生更大的伤害[29]。当植物受到逆境胁迫时体内活性氧物质的大量积累会干扰细胞的代谢和破坏细胞膜的结构和功能[30]。本试验中，镉胁迫下紫苏幼苗SOD、POD、CAT 活性均显著升高，可能是由于在镉胁迫下，植物体启动自身防御系统，通过提高抗氧化酶活性来清除镉胁迫诱导产生的大量自由基；而喷施硒后，随着硒浓度的增加SOD、POD、CAT 活性均呈现先下降后上升的趋势，可能是由于低浓度硒的喷施降低了植株体内镉诱导的活性氧自由基，而高浓度硒对植株同样有毒害作用。值得注意的是，细胞内MDA 含量的高低可反映细胞膜氧化损伤的程度[31-32]。本试验中，镉胁迫使紫苏幼苗，MDA 和O2·-含量均显著升高，表明镉对紫苏的细胞膜产生了一定程度的伤害，使细胞膜的透性增加，加快了脂质过氧化作用；喷施硒后，随着硒浓度的增加，MDA 和O2·-含量均呈现先下降后上升的趋势，说明虽然硒对镉胁迫下的紫苏细胞膜有一定的保护作用，但是过高的硒促进过氧化作用。这与郭锋等[33]在菠菜中的研究结果一致。

可溶性蛋白质是植物体内重要的渗透调节物质，在逆境条件下通过增加可溶性蛋白质的合成，减缓由逆境胁迫造成的生理代谢不平衡[34-35]。本试验中，镉胁迫处理使紫苏幼苗中可溶性蛋白含量显著升高，喷施硒溶液后降低，表明硒对镉胁迫引起的紫苏可溶性蛋白含量的上升具有一定的缓解作用，可有效提高镉胁迫下紫苏的渗透调节能力。

本试验中，镉胁迫下紫苏幼苗地上、根部的生物量和株高显著降低，叶绿素含量显著减少，光合速率和蒸腾速率显著降低，抗氧化酶活性、O2·-和MDA含量显著升高，渗透调节物质含量显著升高，说明镉胁迫显著抑制紫苏幼苗生长。叶片喷施外源硒后，以上指标均得到了缓解，其中，1 μmol/L 硒的缓解效果最好，说明喷施适宜浓度的硒可缓解镉对紫苏幼苗生长的胁迫伤害，提高紫苏幼苗对镉的耐受性。为进一步研究紫苏对镉的耐受机制奠定理论基础。