酶与微生态复合组剂对小鼠生长性能、血液指标及肠道MUC2 表达的影响

裴 婷，孔佳美，白培钿，杨逢清，李 涛，张瑞杰，任玉红

（山西农业大学动物医学学院，山西太谷030801）

随着我国养殖业的迅速发展，抗生素被作为饲料添加剂广泛应用于疾病防治、营养水平提升、养殖改善等各个方面[1]，但是由于经济效益的驱使和监督管理不严，出现了抗生素、喹乙醇、喹诺酮等药物的滥用，造成大肠杆菌、沙门氏菌等细菌产生耐药性，使得药物疗效大大降低甚至没有效果，这些药物也会在畜禽产品中大量残留，会直接影响食品安全和危害人类健康，因此，无抗养殖的呼声越来越高[2]。我国农业农村部于2017 年6 月发布《全国遏制动物源细菌耐药行动计划（2017—2020 年）》的通知，要求我国于2020 年起全面禁止人兽共用抗菌药物或易产生交叉耐药性的抗菌药物作为动物促生长剂应用于动物生产中[3]。找到抗生素替代品、控制抗生素的使用量成为当前要解决的重要课题。酶制剂[4]、益生菌[5]、复方中草药[6]等抗生素替代品在养殖场的应用，已成为禽畜养殖的发展趋势。大量试验表明，酶制剂具有降解抗营养因子、补充内源酶、解离金属元素、增强机体免疫力等作用[7]；益生菌则能够调节动物肠道微生态平衡、增强机体免疫力等功能[8]。二者联合使用时能够进一步改善动物机体健康，提高饲料利用率，从而达到更加理想的生产应用效果[9]。

肠道黏膜免疫系统是肠道屏障的重要组成部分，与肠道上皮细胞相互作用、相互影响，保护小肠不受细菌、病毒等微生物的侵袭和侵害，防止小肠对外来有害物质的吸收，起到机体第一道防线的作用[10]。肠道MUC2 是构成肠道黏液层的主要成分，主要是由杯状细胞分泌的高分子糖蛋白，在组织和血液中还有细胞粘附、参与淋巴细胞循环、参与细胞间通讯和信息传递、维持细胞的极性、参与抗原呈递和淋巴细胞活化作用等[11-12]。检测肠道黏膜MUC2 的表达量能评估机体的肠道黏膜免疫功能。

山西农业大学动物医学学院微生物实验室科研团队自主研发的酶与微生态制剂复合组剂由中性蛋白酶、纤维素酶、枯草芽孢杆菌、啤酒酵母菌、嗜酸乳杆菌组成。本试验通过对小鼠灌胃不同剂量的复合组剂，观察试验小鼠的生长性能，了解酶与微生态制剂复合组剂对小鼠生长状况的影响；测定血液指标，评估酶与微生态制剂复合组剂对小鼠健康状况的影响；采用免疫组化和荧光定量PCR 法测定小鼠空肠和回肠黏膜MUC2 表达量和表达水平，了解复合组剂对肠道黏膜免疫的影响，为酶与微生态制剂复合组剂在畜禽生产中的应用提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

BALB/C 小鼠，购自太谷青牧养殖有限公司，许可证号：SCXK（晋）2019—0005。酶与微生态制剂的复合组剂由山西农业大学动物医学学院实验室自行研制（未申请专利）。

MRS 固体培养基、LB 固体培养基、PDA 培养基（索莱宝）；Trizol（美国life）；反转录试剂盒、实时荧光定量试剂盒（TAKARA），MUC2 抗体（武汉三鹰）；免疫组化试剂盒（康为世纪）等。

1.2 设备

Chemray 800 全自动生化分析仪为深圳雷杜生命科技产品；BC-2800vet 全自动血液细胞分析仪为迈瑞产品；石蜡切片机、石蜡包埋机、摊片机、显微镜为德国Leica 公司产品；定量PCR 检测仪。

1.3 方法

1.3.1 动物分组与饲养 选取48 只的28 日龄BALB/C 小鼠，雌雄各半，体质量为（16±2）g，适应性饲养7 d 后，按照随机分组原则分为4 组，每组雌雄各6 只，分别为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。对照组灌胃0.2 mL 无菌蒸馏水，低、中、高剂量组分别以2.5、5、10 g/kg 灌胃酶与微生态制剂复合组剂持续灌胃28 d。试验期间同室分笼喂养，自由采光和饮水。

1.3.2 生长性能测定 试验期间观察小鼠的精神状态、饮食情况、被毛光泽度情况，每隔7 d 对小鼠进行称质量并记录。

1.3.3 血液指标检测 28 d 后禁食12 h，摘取小鼠眼球采血，部分置于EDTA 抗凝管内收集全血，用于血液生理指标检测；部分置于非抗凝采血管内，血液静置2 h 或4 ℃过夜，凝结后以3 000 r/min 离心10 min，取血清，放置-80 ℃保存，用于全自动生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、血尿素氮和肌酐含量。

1.3.4 免疫组化检测MUC2 含量 28 d 后禁食12 h，颈椎脱臼处死小鼠，进行解剖检查，取空肠、回肠组织固定于4%的多聚甲醛溶液中，冲水，脱水，石蜡包埋，切片。组织切片进行脱蜡，并用柠檬酸钠抗原修复液进行高温修复，应用免疫组化试剂盒进行一抗和二抗的孵育，DAB 显色，苏木精染色，0.1%盐酸酒精分化，自来水和0.1%氨水返蓝，组织切片进行梯度酒精脱水，封片。用光学显微镜观察，是否出现棕黄色颗粒，有棕黄色颗粒为阳性。并随机选取5 个视野，通过Image J18.0 软件进行图像分析MUC2 含量。

1.3.5 肠道黏膜MUC2 mRNA 相对表达量的测定将小鼠的空肠和回肠组织用液氮处理，用trizol 法进行总RNA 的提取。按照反转录试剂盒说明书进行RNA 的反转录获取cDNA，进行荧光定量PCR。根据NCBI 上基因数据库查找目的基因MUC2 以及内参GAPDH 相对应的基因序列，运用Primer 5.0软件设计各基因的上下游引物（表1）。PCR 反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，65 ℃延伸30 s，40 个循环。

表1 引物序列

1.4 数据处理

使用SPSS 21.0 统计软件进行数据处理，并采用单因素分析进行统计分析及显著性检验。试验数据以平均值±标准差表示，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 酶与微生态制剂复合组剂对小鼠生长性能的影响

小鼠灌胃酶与微生态制剂复合组剂后精神状态无异常，生长状况良好，呼吸正常，体质量增加，被毛有光泽。用不同剂量的复合组剂灌胃小鼠后，体质量变化如表2 所示。从表2 可以看出，小鼠在灌胃不同剂量的酶与微生态制剂复合组剂后，7、14 d，各组小鼠体质量均有所增加，但无显著差异性（P＞0.05）；在21 d，中剂量组和高剂量组的小鼠体质量增加明显，差异显著（P＜0.05），低剂量组的小鼠体质量无显著差异性（P＞0.05）；28 d 时，各试验组的小鼠体质量明显增加，差异性显著（P＜0.05）。

表2 各组小鼠体质量结果比较 g

2.2 酶与微生态制剂复合组剂对小鼠血液指标的影响

由表3 可知，试验组和对照组的血常规指标均在正常范围内。其中，灌胃中剂量和高剂量的试验组小鼠白细胞总数及淋巴细胞数均比对照组高，且差异显著（P＜0.05）。由表4 可知，试验组和对照组的丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、血尿素氮和肌酐的生化检查结果均在正常范围内，且无明显差异（P＞0.05）。

表3 各组小鼠血常规结果比较

表4 各组小鼠血清生化指标结果比较

2.3 酶与微生态制剂复合组剂对肠黏膜MUC2 表达水平的影响

免疫组化结果如图1、2 所示，对照组和各试验组空肠和回肠黏膜表面均有MUC2 的表达，与对照组相比，各试验组肠道黏膜表面MUC2 的表达量增高。通过Image J18.0 软件进行图像分析MUC2 含量，结果如图3、4 所示，与对照组相比，灌胃低剂量复合组剂的空肠黏膜表面MUC2 表达量增加，且差异显著（P＜0.05），低剂量复合组剂的回肠黏膜表面MUC2 表达量无明显差异（P＞0.05）；灌胃中剂量复合组剂小鼠的空肠和回肠黏膜表面MUC2 表达量增加，且差异均极显著（P＜0.01）；灌胃高剂量复合组剂小鼠的空肠和回肠黏膜MUC2 表达量增加，且差异均显著（P＜0.05）。

2.4 酶与微生态制剂复合组剂对肠黏膜MUC2 mRNA 表达水平的影响

荧光定量PCR 结果显示（图5、6），灌胃酶与微生态制剂复合组剂小鼠的肠道黏膜MUC2 mRNA表达水平不同程度高于对照组。与对照组相比，低剂量组小鼠空肠和回肠的MUC2 mRNA 表达水平增加，差异达显著水平（P＜0.05）；中剂量组空肠和回肠MUC2 mRNA 表达水平增加，差异达极显著水平（P＜0.01）；高剂量组小鼠空肠MUC2 mRNA 表达水平增加，差异达显著水平（P＜0.05），回肠mRNA 表达水平增加，差异达极显著水平（P＜0.01）。

3 结论与讨论

近年来，人们对替代抗生素产品的研究日益深入，酶制剂和微生态制剂的应用逐渐成为发展趋势，也日益受到重视。本研究表明，酶与微生态制剂复合组剂作为新型饲料添加剂对小鼠生长具有促进作用，这是由于复合组剂是由益生菌和酶制剂复合而成。益生菌能够增加动物小肠的黏膜皱裂，增加绒毛长度，加深陷窝深度，使小肠吸收面积增大，促进营养的吸收，也能够提供动物生长发育所必需的部分营养物质、酶及调节因子，促进动物生长[13-14]。酶制剂能消除饲料中抗营养因子或有害物质，提高饲料的营养，同时能补充内源性消化酶的不足，促进消化吸收[15-16]。两者共同作用可以促进饲料在小鼠体内的消化与吸收，促进小鼠生长，提高其生长性能。

血常规和血清生化指标检查可以反映动物机体的健康水平，用于评估机体的健康状况[17-20]。丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶是参与氨基酸代谢的酶，是肝脏功能损伤最敏感的检测指标，它常出现于形态学发生变化之前[21]。肌酐、血尿素氮是判定肾脏是否损伤的重要指标，可判断肾功能是否正常[22]。本试验表明，小鼠灌胃28 d 后，各组小鼠的血常规和血清生化指标均在正常范围内，表明酶与微生态制剂复合组剂不会引起小鼠肝肾功能损伤。白细胞不仅参与机体的非特异性免疫，还参与机体的特异性免疫，具有强大的吞噬能力和免疫功能[23-24]。血液中淋巴细胞是由淋巴结、脾脏等淋巴组织释放而来，具有保护机体的作用。田其真等[25]给健康犬连续口服28 d 唾液乳酸杆菌TCSL1 后，犬的淋巴细胞数、红细胞数显著增加，白细胞数、单核细胞数和血红蛋白含量相对升高，表明口服唾液乳酸杆菌TCSL1 能增强犬的免疫功能。本试验表明，中剂量组的白细胞和淋巴细胞数量显著高于低剂量组和高剂量组，高剂量组比低剂量组的值略高，说明酶与微生态制剂复合组剂具有增强免疫和抵抗感染的作用。

MUC2 可在肠道的表面形成一层黏液层，起到润滑和拮抗致病菌的肠道粘附和侵袭的作用[26]。微生物及其代谢产物可以影响MUC2 的合成与分泌，调节MUC2 的生成，如牙双歧杆菌可通过刺激杯状细胞自噬来调节黏液的合成并上调MUC2 黏蛋白的分泌[27]。ROKANA 等[28]研究发现，益生菌可以与肠细胞表面的Toll 样受体4（TLR4）结合，通过MyD88 途径刺激NF-κB，从而上调MUC2 黏蛋白的表达。本试验表明，不同剂量的复合组剂均能增加空肠和回肠中MUC2 含量，提示酶与微生态制剂复合组剂能通过增加MUC2 蛋白含量来加强肠道的黏液屏障，提高机体对致病菌的防御作用。

黏液蛋白的合成和分泌依赖于其mRNA 的表达，本试验应用荧光定量PCR 对不同处理的小鼠空肠和回肠段MUC2 的mRNA 的相对表达量进行了评价。本试验结果表明，试验组中空肠和回肠内MUC2 mRNA 的表达量比对照组高，且中剂量组的表达量最高，这与免疫组织化学法检测的空肠和回肠内蛋白含量结果基本一致，揭示酶与微生态制剂复合组剂能够提高肠道内MUC2 mRNA 的表达，并且促进黏蛋白MUC2 的合成和分泌。

综上所述，酶与微生态制剂复合组剂对实验小鼠的生长具有促进作用；能提高血液中白细胞和淋巴细胞的数量，增加机体的抵抗力；能够增加肠道MUC2 的含量和mRNA 表达量，增强肠道屏障功能，可为酶与微生态制剂复合组剂在养殖生产中的应用提供参考。