亚麻荠CsLEC1 基因家族的鉴定及其在种子发育时期的表达分析

王志龙，周雅莉，邓咪咪，郝月茹，薛应红，薛金爱，苑丽霞，李润植

（1.山西农业大学分子农业与生物能源研究所，山西太谷030801；2.晋中学院生物科学与技术学院，山西晋中030600）

亚麻荠（Camelina sativa（L.）Crantz）是一种十字花科亚麻荠属的油料作物，具有耐低温、耐旱、栽培简单且生育期短等特点，因此，其栽培和应用日益广泛[1]。亚麻荠种子中含有多种对人体有益的不饱和脂肪酸，是一种新型的油料作物，亚麻荠种子含油量高达52%，含有油酸、亚油酸、亚麻酸等多种不饱和脂肪酸，其中，α- 亚麻酸的含量高达30%[2-4]。已有研究证明，α- 亚麻酸具有增强人体免疫力、调节血脂、降压降糖、延缓衰老等功效[5-7]。此外，亚麻荠油还可作为航天航空等生物燃油使用，在生物新能源领域具有巨大的开发潜力[8-9]。迄今为止，亚麻荠种子中的脂肪酸合成代谢机制还尚未完全解析，因此，对亚麻荠油脂合成机制的深入研究具有一定的实践意义和应用价值。

LEC1（Leafy Cotyledon1）是编码CCAAT-Box结合因子（CAAT box-binding factors，CBF）HAP3（Heme-activated protein）的一个亚基，是胚发育的一个重要调控因子，可调控多个成熟特异性基因的表达，增加种子贮藏蛋白的积累[10-11]。近年来，已有研究发现，LEC1参与脂肪酸的合成调控。LEC1过量表达可以调控油脂合成通路中多个脂肪酸相关基因的表达，从而改变脂肪酸的成分和含量。在拟南芥中，过表达LEC1可导致TAG 含量的增加，增加种子含油量[12]。玉米ZmLEC1基因过表达使突变体的种子含油量增加了48%[13]，通过基因共表达分析表明，ZmLEC1直接或间接调节ZmWRI1的表达。TAN 等[14]在油菜种子中特异表达BnLEC1，使转基因油菜种子含油率提高2%～20%，且对主要农艺性状无负调控作用。异位表达LEC1同样可调节与激素响应相关和光响应相关基因的表达[15]。可见，LEC1在植物的油脂合成过程中发挥着重要作用，然而，在亚麻荠中还未见LEC1转录因子的相关报道。

基于已经公布的亚麻荠基因组数据[16]和已知功能的拟南芥AtLEC1 同源蛋白序列[12]，本研究通过对亚麻荠CsLEC1基因家族的鉴定、蛋白理化性质和结构分析、系统进化分析以及CsLEC1基因在种子不同发育时期的表达模式分析，旨在揭示CsLEC1 蛋白结构和功能，为阐明亚麻荠CsLEC1基因对种子中油脂的合成调控机制和优良品种选育提供理论依据。

近日，中共漳州市委、漳州市人民政府印发《关于加强和完善城乡社区治理的实施意见》（漳委发〔2018〕15号），明确漳州市将降低门槛，鼓励家庭服务性质的创业。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以山西农业大学农作站试验田正常生长的亚麻荠种子为材料，采集开花后10、20、30、40 d 的亚麻荠种子，用液氮冷冻后于-80 ℃下贮存。

1.2 亚麻荠LEC1 基因家族成员鉴定

利用ProtParam 对亚麻荠CsLEC1编码蛋白的理化性质进行分析，结果如表3 所示，CsLEC1的开放阅读框为720～726 bp，编码239～241 个氨基酸，分子质量为25.89～26.10ku；CsLEC1-1 和CsLEC1-3为稳定蛋白（不稳定系数＜40），CsLEC1-2 为不稳定蛋白（不稳定系数＞40）；理论等电点小于7，均为酸性蛋白；亲水性指数为负值，均为亲水性蛋白。3 个CsLEC1 蛋白均无跨膜结构域和信号肽存在，且定位于细胞核，据此推测均属非分泌型蛋白。

采用同源建模对三级结构进行预测，以拟南芥组蛋白折叠二聚体“L1L NF-YC3”的晶体结构（5g49.1 蛋白）[20]为模板，对CsLEC1 蛋白进行同源建模，结果如图2 所示，亚麻荠3 个CsLEC1 蛋白与该模板蛋白的序列相似性和覆盖率均为58%和38%，且3 个蛋白均以单体形式发挥作用。在亚麻荠CsLEC1 蛋白三级结构内可见3 个α 螺旋和2 个环结构，三维模型一样，说明该家族基因功能可能高度一致。

1.3 CsLEC1 基因编码蛋白理化性质和蛋白结构分析

利用Expasy 工具ProtParam（http://www.expasy.org/tools）分析CsLEC1编码蛋白的理化性质；利用TMHMM Server 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析CsLEC1 蛋白的跨膜结构域；利用SignalP-5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测CsLEC1 蛋白的信号肽；使用WoLF PSORT（https://www.genscript.com/wolf-psort.html）预测CsLEC1 蛋白的亚细胞定位。利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html） 预测二级结构；利用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）预测三级结构。

1.4 CsLEC1 蛋白多序列比对和系统发育分析

多序列比对结果如图1 所示，亚麻荠CsLEC1氨基酸序列中均含有3 个α 螺旋（蓝色横线标注）和2 个L 环（红色横线标注），4 个LEC1 蛋白中均含有HAP3 亚基中高度保守的B 结构域（灰色区域标出）。其中，α1 螺旋中存在DNA 结合序列“MPIANVI”，可以与CCAAT 结合因子相互作用；α2螺旋中存在亚基间相互作用的序列“IQECVSECISFI”[17-18]。在L1 组蛋白折叠基序和α2 螺旋结构之间还存在1 个天冬氨酸Asp 残基（红色区域标出），该氨基酸残基被证明是LEC1 蛋白中B 结构域内的重要功能位点，参与调控种子胚胎的形成[19]。

表1 其他物种的LEC1 蛋白基本信息

1.5 CsLEC1 基因在种子中的表达量分析

耳聋筛查在正常听力育龄妇女中可有效检出大量潜在的耳聋携带者，可以有效地避免耳聋患儿的出生，对于预防药物性耳聋也是很有效的检出手段。随着耳聋出生缺陷预防工程在临床的铺展，一些检测或者遗传咨询过程中遇到的问题也在增多，如检测假阳性、表型-基因型差异性问题，对于检测人员及遗传咨询医生都需要不断完善自我。

对获得的3 个CsLEC1基因，利用Primer 6.0 软件设计PCR 引物，引物信息如表2 所示。使用艾德莱公司的EASYspin 植物RNA 快速提取试剂盒提取亚麻荠种子的RNA，使用ABM 公司的反转录试剂盒合成cDNA 的第1 链用于后续试验。以亚麻荠CsActin基因为内参，用Genstar 公司的2×增强型染料实时荧光定量PCR 预混液进行qRT-PCR 试验，反应体系为：正向和反向引物各0.2 μL、cDNA模板0.5 μL、2×RealStar Green Power Mixture 5 μL、RNase-free H2O 4.1 μL，共10 μL。采用3 步法荧光定量反应程序：95 ℃10 min；95 ℃15 s，59.9 ℃1 min，72 ℃30 s，40 个循环。根据2-ΔΔCt计算相对表达量。每个样品进行3 次生物学重复。

表2 试验所用引物

2 结果与分析

2.1 亚麻荠CsLEC1 编码蛋白的理化性质分析

本试验用拟南芥AtLEC1 蛋白序列（＞NP_173616.2）为检索序列，在亚麻荠基因组数据库（http://www.camelinadb.ca/）中BLAST 分析，获得亚麻荠CsLEC1基因序列，鉴定获得3 个亚麻荠CsLEC1基因，分别命名为CsLEC1-1（Csa03g-025850.1）、CsLEC1-2（Csa14g027200.1）、CsLEC1-3（Csa17g028800.1）。

二级结构的预测结果如表4 所示，亚麻荠CsLEC1 蛋白的二级结构由α 螺旋、β 转角、无规则卷曲和延伸链4 种结构组成，且4 种结构中，α 螺旋与无规则卷曲所占的比例最大。

表3 CsLEC1 蛋白的基本理化性质

2.2 CsLEC1 氨基酸多序列比对

使用Genedoc 软件对CsLEC1 和拟南芥AtLEC1 进行氨基酸多序列比对。用MEGA 7.0 中邻接法构建CsLEC1 蛋白和其他物种LEC1 蛋白（表1）的系统发育树。

2.3 CsLEC1 蛋白高级结构分析

②锚杆布置：锚杆排距1.0 m，每排13根。拱基线位置每侧各打设一根，拱基线往下各布置5根锚杆，间距0.9 m。

根据上述分析，产业创新速度对创新效益的影响可能存在非线性关系，即门槛效应。以单门槛为例，如果存在1个创新速度门槛水平τ，当S≤τ以及S＞τ时，产业创新速度对创新效益的弹性系数并不一致，并呈现出显著的差异，为此引入虚拟变量Di:

表4 CsLEC1 蛋白的二级结构分析 %

长期以来，我国的传统金融业无法满足居民的投资需求。股票市场波动较大风险高，银行存款收益率低，收益率和风险无法同时满足投资者的需求。个人理财产品的出现很好的解决了这一矛盾，虽然存在一定风险，但是相比于股市，个人理财产品的风险要小很多，与此同时个人理财产品的收益有远远高于银行的固定存款。因此在很大程度上满足了市场上大部分风险厌恶型的投资者。

2.4 CsLEC1 蛋白与其他物种LEC1 蛋白的系统进化树分析

利用MEGA 7.0 构建进化树如图3 所示，LEC1 同源蛋白分为2 个亚族，即亚麻荠CsLEC1蛋白与拟南芥AtLEC1 蛋白、甘蓝型油菜BnLEC1蛋白聚为一族，分析发现，这3 种植物均属于十字花科植物，可能其有共同的进化来源和发挥相同的功能。该结果为后续解析亚麻荠CsLEC1基因的功能提供了重要的参考信息。

2.5 CsLEC1 基因的表达模式分析

通过对亚麻荠的转录组数据[21]分析得知，CsLEC1基因仅在种子中有转录表达，亚麻荠种子是油脂的主要储存器官，为探究亚麻荠CsLEC1基因在不同发育时期种子中的表达情况，以亚麻荠CsActin作为内参基因，通过qRT-PCR 分析亚麻荠不同发育时期种子中CsLEC1基因的表达模式，结果如图4 所示，在开花后10 ～20 d 的种子中，亚麻荠3 个CsLEC1基因表达量均逐渐升高，且在开花后20 d 表达量达到最大；随着种子的发育成熟，3 个基因表达量逐渐降低。

3 结论与讨论

本研究以拟南芥AtLEC1 蛋白序列为同源序列，在亚麻荠基因组数据库中BLAST 得到3 个CsLEC1 蛋白编码基因，分别命名为CsLEC1-1、CsLEC1-2和CsLEC1-3。经过理化性质分析表明，亚麻荠CsLEC1 蛋白定位于细胞核中，为不含有跨膜结构域和信号肽的酸性、亲水性蛋白，与拟南芥AtLEC1 的氨基酸理化性质相似。蛋白结构发现，亚麻荠CsLEC1 蛋白中含有3 个α 螺旋结构和2 个环结构，为HAP3 高度保守的B 结构域，证明这3 个CsLEC1 蛋白都属于LEC1 家族。HAP3 亚基由A、B、C 共3 个结构域组成[19]，其中，B 结构域中具有5 个组蛋白折叠基序，3 个α 螺旋（α1、α2、α3）和2 个环结构（L1、L2），α1 螺旋中存在DNA 结合序列MPIANVI，可与CCAAT 结合因子相互作用；α2 螺旋中存在亚基间相互作用的序列IQECVSECISFI[17-18]。CsLEC1 蛋白中α1 螺旋结构中存在DNA 结合序列（MPIANVI），证明CsLEC1 可以起到转录激活作用。LEE 等[19]研究发现，在拟南芥AtLEC1 的氨基酸序列中第55 位是天冬氨酸，该残基被证明是LEC1蛋白中B 结构域内的重要功能位点，参与调控种子胚胎发育过程。从多序列比对结果可以看出，亚麻荠CsLEC1 在对应位置也存在天冬氨酸残基，推测这3 个CsLEC1 蛋白具有与拟南芥AtLEC1 蛋白有相似的功能。亚麻荠CsLEC1 蛋白的二级结构和三级结构均与拟南芥AtLEC1 蛋白相似，三级结构中还可以明显地看到与多序列比对结果相同的5 个组蛋白折叠基序。系统进化树表明，亚麻荠CsLEC1与拟南芥AtLEC2、甘蓝型油菜BnLEC1 同源性较高，可能其具有相同的功能。

LOTAN 等[22]研究发现，拟南芥AtLEC1基因在种子中特异表达。文冠果XsLEC1基因在文冠果的根、茎、叶及花中均无表达，在种子中具有较高的表达，且是在种胚发育的前期表达量最高[23]。本研究表明，实时荧光定量结果显示，亚麻荠CsLEC1在开花后10～20 d 的种子中高表达，在开花后20 d的表达量达到最高；随着种子发育成熟，CsLEC1表达量呈现逐渐降低趋势，至种子发育晚期停止表达。因此，推测CsLEC1基因参与了亚麻荠种子的生长发育过程。研究表明，拟南芥中过表达LEC1可以激活油脂相关转录因子FUS3、ABI3、WRI1的表达[12]。为此，推测该基因在种子发育早期过程中参与了种子油脂的合成，在CsLEC1高表达的同时激活了下游基因的表达，并参与种子油脂的合成。在拟南芥中，过表达LEC1基因可以使TAG 的含量增加，同时也会上调FAD2基因的表达量[24]。FAD2可以将油酸合成亚油酸，是亚油酸合成的关键酶[25]。而亚油酸是合成α- 亚麻酸的重要底物，因此，通过对CsLEC1基因的深入研究将有助于提高亚麻荠中α- 亚麻酸的含量。

本研究鉴定得到3 个CsLEC1基因，编码蛋白均含有“α1-L1-Asp-α2-L2-α3”结构域，为HAP3亚基的B 结构域，Asp 是LEC1 的功能位点；在开花后20 d 的种子中表达量最高。说明CsLEC1基因可能参与调控胚胎发育，而其与脂肪酸成分和含量的相关性以及油脂合成通路中的具体调控机制还有待进一步探究。