正交试验优化好食脉孢菌类胡萝卜素提取工艺

卫 阳，杨继业，陈书明，张希春，张 瑜，陈亚伟，封健健,鲍琳杰

（1.山西农业大学动物医学学院，山西太谷030801；2.山西省畜牧遗传育种中心，山西太原030027；3.山西中医药大学中药与食品工程学院，山西晋中030619）

由于类胡萝卜素具有维生素A 原活性、抗氧化、提高免疫力、着色等多种生理功能[1]，故被广泛用于食品、饲料、化妆品等行业[2]。由瑞士Roche 公司和德国BASF 公司提供的化学合成产品占全球近80%类胡萝卜素市场份额[3]，而部分化学合成的部分类胡萝卜素已经被发现有害，受到人们的抵制[4-5]，天然类胡萝卜素更加受人们青睐。天然类胡萝卜素主要源于植物提取和微生物提取，植物提取受季节因素影响大，规模生产受限制；而微生物提取则由于对营养要求低、条件易控、周期短等优点而拥有更为广阔的市场前景，越来越受到研究者的关注。

脉孢菌为丝状真菌属，其分生孢子内均蕴含大量类胡萝卜素[6-8]，PRIATNI[9]对脉孢菌属产类胡萝卜素的前景进行了展望。好食脉孢菌作为FDA 认证的可食用安全菌种，由于其孢子内富含类胡萝卜素，生长速度快[10]，已被广泛用于生产类胡萝卜素的应用研究[11]。但由于好食脉孢菌所产类胡萝卜素主要存在于孢子内[12]，而孢子具有极难裂解的孢子壁，使得类胡萝卜素很难被释放；因此，提高孢子内类胡萝卜素的释放率，寻求高效率的类胡萝卜素提取方法，对其规模化生产至关重要。

由于类胡萝卜素存在于微生物不同的部位，因此，类胡萝卜素的提取方法有所差异。目前，浸提法、研磨法、酶反应法、超声波提取法和酸热破壁法等是类胡萝卜素的常见提取方法。其中，浸提法、研磨法和超声波提取法对好食脉孢菌孢子中类胡萝卜素提取效果较差；酶反应法虽然可以较好地提取类胡萝卜素，但成本高；而酸热破壁法不仅提取效果较好，成本低，且采用酸热破壁法提取好食脉孢菌孢子内类胡萝卜素的引用较广泛[13]，但是酸热破壁过程中酸浓度、用量及热处理时间不一致，导致类胡萝卜素提取量差异较大。

为了提高好食脉孢菌孢子内类胡萝卜素提取量，本试验对酸热破壁法提取类胡萝卜素工艺中的盐酸浓度、盐酸用量、振荡时间和沸水浴时间分别进行了单因素试验，通过正交试验优化出高效提取好食脉孢菌孢子内类胡萝卜素的工艺。

1 材料和方法

1.1 材料

好食脉孢菌（Neurospora sitophila），山西农业大学发酵工程实验室保存。玉米秸秆由山西农业大学国家现代肉羊产业技术体系饲料资源岗位试验基地提供。

琼脂粉、蛋白胨均购自Solarbio，其他试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 好食脉孢菌菌种活化与液体种子液制备

1.2.1.1 菌种活化 挑取PDA 固体斜面培养基[14]上的好食脉孢菌孢子分散于20.0 μL 无菌水中，用接种环划线接种至PDA 固体培养基，于29.0 ℃、湿度70.0%培养4 d，备用。

1.2.1.2 液体种子液制备 取活化后的好食脉孢菌孢子分散于无菌水（1.4×106cfu/mL）中，按1/50 接种量接种至液体种子培养基[14]，于29.0 ℃、200 r/min培养2 d，即为液体种子液。

1.2.2 好食脉孢菌发酵玉米秸秆获得好食脉孢菌孢子 取干燥揉丝玉米秸秆10.0 g 放于1.0 L 烧杯，加27.0 mL 蒸馏水，搅拌均匀，121 ℃灭菌20.0 min，于超净工作台中冷却，备用。接种好食脉孢菌种子液3.0 mL，搅拌均匀，于29.0 ℃、湿度70.0%培养箱中发酵96.0 h，取出发酵产物，加入蒸馏水充分搅拌洗涤，4 层纱布过滤并收集滤液，5 000 r/min 离心10.0 min，弃上清，沉淀（好食脉孢菌孢子粗品）在通风处晾干、称质量，备用。

1.2.3 好食脉孢菌孢子类胡萝卜素提取工艺优化好食脉孢菌孢子中类胡萝卜素的提取采用盐酸热破壁法。称取10.0 mg 好食脉孢菌孢子，置于50.0 mL离心管，加入10.0 mL 盐酸（3.0 mol/L），恒温振荡（25 ℃，100 r/min）45.0 min，再将离心管置于沸水中（拧松离心管盖子）进行沸水浴10.0 min，迅速置于冰水冷却，并调节酸解液pH 值至7.0，4 500 r/min离心10.0 min，弃上清，沉淀即为破壁的好食脉孢菌孢子，加入丙酮充分浸提，离心（4 500 r/min，10.0 min），收集上清液，重复丙酮浸提步骤，直至提取液为无色时，结束浸提，合并丙酮提取液并记录体积。类胡萝卜素提取量计算公式参考文献[14]。

为了优化酸热破壁法提取好食脉孢菌孢子类胡萝卜素的工艺，首先对影响类胡萝卜素提取量的4 个因素（盐酸浓度、盐酸用量、振荡时间、沸水浴时间）进行单因素试验，单因素试验水平如表1 所示。盐酸浓度单因素试验中其他因素参数为：盐酸用量1.0 mL/mg，振荡30 min，沸水浴时间10 min；盐酸用量单因素试验中其他因素参数为：盐酸浓度3.0mol/L，振荡30 min，沸水浴时间10 min；振荡时间单因素试验中其他因素参数为：盐酸浓度3.0 mol/L，盐酸用量1.0 mL/mg，沸水浴时间10 min；沸水浴时间单因素试验中其他因素参数为：盐酸浓度3.0 mol/L，盐酸用量1.0 mL/mg，振荡30 min。单因素试验中好食脉孢菌孢子量均为10.0 mg，丙酮用量均为20.0 mL。然后采用4 因素、3 水平正交试验（表2）优化好食脉孢菌孢子类胡萝卜素提取工艺。

为了检验优化结果的有效性，对优化结果进行验证试验，即在优化结果参数下，对好食脉孢菌孢子进行破壁，并测定类胡萝卜素提取量，同时统计所有试验结果，若验证试验结果均高于其余各试验组结果，则说明优化结果有效。

表1 好食脉孢菌孢子类胡萝卜素提取单因素试验

表2 好食脉孢菌孢子类胡萝卜素提取正交试验因素水平

1.3 统计分析

采用SPSS 20.0 软件对试验数据进行多重比较及独立样本t检验，Graph Pad Prism 5.0 软件对试验数据作图。

2 结果与分析

2.1 类胡萝卜素提取单因素试验结果

从图1 可以看出，酸热破壁时，随盐酸浓度、盐酸用量、振荡时间以及沸水浴时间的增大，类胡萝卜素的提取量均呈现出先升后降的趋势，当盐酸浓度为1.0 mol/L，盐酸用量为0.3 mL/mg 时，振荡时间为30 min 时，类胡萝卜素提取量分别为最大值，且分别与临近检测点差异显著（P＜0.05）。从图1 还可以看出，酸热破壁时，随着沸水浴时间的延长，类胡萝卜素的提取量呈现逐渐上升后缓慢下降的变化趋势，沸水浴8、9 min 时，提取量最大差异不显著（P＞0.05），但是均显著高于7、10 min 的提取量（P＜0.05）。

2.2 正交试验

依据单因素试验结果，选取了盐酸浓度、盐酸用量、振荡时间、沸水浴时间4 个因素的3 个水平（表2），并设计L9（34）正交试验（表3）。

从表3 可以看出，在酸热破壁法提取类胡萝卜素过程中，由4 个因素的极差R 值大小（R 值越大，影响越大）可知，影响因素从大到小排序为B＞A＞D＞C，即盐酸用量＞盐酸浓度＞沸水时间＞振荡时间。因此，最优工艺为A2B2C2D3，即盐酸浓度1.0mol/L、盐酸用量0.3 mL/mg、振荡时间为30 min、沸水浴时间8 min。

表3 类胡萝卜素提取的正交试验结果L9（34）

2.3 验证试验

从表3 可以看出，类胡萝卜素提取量最大为11.3 mg/g，试验组合为A2B2C3D1。由于最优水平（A2B2C2D3）没有出现在正交表中，故对其进行验证试验。通过试验验证优水平A2B2C2D3，得出类胡萝卜素提取量为（11.4±0.6）mg/g，此结果高于表3正交试验中所有组合试验结果，因此，最优组合验证成功，即酸热破壁工艺参数组合为盐酸浓度1.0 mol/L、盐酸用量0.3 mL/mg、振荡时间30 min、沸水浴时间9 min。

2.4 工艺优化前后好食脉孢菌孢子类胡萝卜素提取量的比较

工艺优化前类胡萝卜素提取主要工艺参数是：盐酸浓度3.0 mol/L、盐酸用量1 mL/mg、振荡时间45 min、沸水浴时间10 min，类胡萝卜素提取量为（9.3±0.5）mg/g。工艺优化后类胡萝卜素提取主要工艺参数是：盐酸浓度1.0 mol/L、盐酸用量0.3 mL/mg、振荡时间30 min、沸水浴时间9 min，类胡萝卜素提取量为（11.4±0.6）mg/g，比工艺优化前提高了22.6%（P＜0.01）。

3 结论与讨论

类胡萝卜素是脂溶性萜类化合物，可以根据相似相溶原理，使色素溶解在极性相近的有机溶剂中[15]，再用紫外分光光度法对其含量进行测定[16]。但是，其孢子壁结构紧密，难以裂解[17]，类胡萝卜素难以释放。提取类胡萝卜素方法多样[18]，但采用酸热破壁法和有机溶剂浸提法的应用最为广泛[19]，其中，大多选用盐酸结合热处理，但是盐酸浓度以及热处理时间不统一[20-21]，使得类胡萝卜素提取量差异较大。刘志刚[12]对粗糙脉孢菌孢子中类胡萝卜素采用不同方法提取，发现酸热法提取率最高，并用响应面法对其进行优化得到最优提取工艺，使类胡萝卜素提取量提高。本试验为了提高好食脉孢菌孢子类胡萝卜素提取量，针对盐酸浓度、盐酸用量、振荡时间以及沸水浴时间分别进行单因素试验，并通过正交试验对上述4 因素进行组合试验，以期优化出最优组合。对于提取剂的选取，山西农业大学动物医学学院发酵工程课题组通过对不同有机溶剂进行筛选，发现丙酮作为提取剂时，提取剂用量少，并且提取彻底，因此，选用丙酮进行后续提取剂。本试验最终得到好食脉孢菌类胡萝卜素提取最优组合为盐酸浓度1.0 mol/L、盐酸用量0.3 mL/mg、振荡时间30 min、沸水浴时间9 min，在该组合条件下，类胡萝卜素提取量最高为（11.4±0.6）mg/g，与优化前类胡萝卜素提取量（（9.3±0.5）mg/g）相比，显著提高了22.6%（P＜0.01），为工业化提取好食脉孢菌孢子中类胡萝卜素提供了工艺参考。

本试验优化后的方法提高了类胡萝卜素的提取量，降低了盐酸浓度[21]，既减少了盐酸用量又节约了振荡和沸水浴时间，大大提高了类胡萝卜素的提取量和提取效率。

本试验酸解选用盐酸，虽然优化后类胡萝卜素提取量提高，但分析认为，由于盐酸酸性强，对释放出的类胡萝卜素会造成破坏，对提取出的类胡萝卜素活性有不利影响。因此，为了保护类胡萝卜素在提取过程中不被损耗，更为优质的提取方法还有待探索；且弱酸、弱碱或者其他更好的处理方法裂解孢子壁，并最大程度地减小由于破壁因素对类胡萝卜素造成不利影响的研究鲜有报道。因此，山西农业大学动物医学学院发酵工程课题组将探讨弱酸、弱碱或其他破壁方法对好食脉孢菌孢子的破壁效果，以期优化出绿色环保的好食脉孢菌孢子破壁方法，提高类胡萝卜素提取量，为工业化生产提供工艺参考。