狂犬病病毒CTN-1 株在人用狂犬病疫苗中的应用及研究进展

石磊泰 综述，李玉华 审校

中国食品药品检定研究院，北京 102629

狂犬病病毒CTN-1 株由中国药品生物制品检定所（现中国食品药品检定研究院）分离并保存。CTN-1 株是1956 年从山东省淄博市1 名死于狂犬病的患者脑组织中提取的，当时该病毒被命名为CTN-S1 株，经小鼠脑内连续传代56 代后变为固定毒，被命名为CTN-M 株，后续在KMB-17 细胞上连续传代50 代适应为CTN-1 株。CTN-1 株经全面检定后未发现被外源病毒污染，抗原性与固定毒一致［1-3］。

本文对狂犬病病毒CTN-1 株在狂犬病疫苗中应用的研究进展作一综述。

1 细胞传代适应性

1. 1 在Vero 细胞等传代细胞上的适应性 李宏玲等［4］发现，用Vero 细胞培养CTN 病毒时，CTN-42代病毒和CTN-103 代病毒的滴度在第8 代后显著增加，在第17 代后保持高水平，其中CTN-42 株平均滴度达7.13 lgLD50／mL，CTN-103 株达6.6 lgLD50／mL，且两株病毒增殖高峰均提前3 ～5 d，空斑形态大小也较适应前清晰，直径增大至1. 0 ～1. 5 mm。表明CTN 株在Vero 细胞适应后可达到较高滴度，适用于疫苗生产。

董关木等［5］和王宏伟等［6］进一步证实，CTN-1株用Vero 细胞培养可快速适应，病毒滴度达7. 0 ～7. 5 lgLD50／ mL 以上，可多次收获培养液；在5 ～20 代内，病毒滴度均稳定在7. 0 lgLD50／ mL 左右。后续董关木等［7］对CTN-1 株在Vero 细胞上的吸附及增殖特性进行了研究，结果表明，CTN-1 株对Vero细胞有较强的吸附作用，接触后可大量吸附。MOI为0. 1 时，10 min 内细胞可吸附99%以上的病毒；MOI 为1. 0 时，上清液中有大量病毒无法吸附至细胞上，60 min 后，超过98%的病毒可被吸附。CTN-1株在Vero 细胞中的复制周期小于16 h。此外，细胞内有相当高的传染性病毒颗粒，其滴度同时高于细胞外，72 h 内细胞内外比例基本平衡。CTN-1 株的这一特性表明病毒培养至收获的最佳周期为3 ～4 d，这样当细胞感染时，死亡病毒较少，很容易一次达到最大感染量。

郭金华等［8］观察了狂犬病病毒CTN-1 株在Vero细胞中的生长和感染特征。通过分离和混合的方法确定了Vero 细胞的生长以及细胞内外的病毒含量。结果表明，Vero 细胞的形态随病毒接种时间的变化而变化，不同接种方法的病毒滴度无明显差异。4 ～9 d 病毒滴度最高，第4 天细胞病毒感染率超过80%，第10 天后开始下降，并在第15 天达到最低点。确定了最佳收获时间为4 ～9 d，MOI 为0. 01 ～0. 10。

孙怡等［9］比较了3 种传代细胞系（Vero、BHK-21 和MDCK 细胞）对狂犬病病毒CTN-1 株的敏感性。研究采用混种的方法，将CTN-1 株分别接种至上述3 种不同来源的连续传代细胞系，在不同时间观察3 种细胞的病变情况，同时应用快速免疫荧光灶抑制试验（rapid fluorescence focus inhibition test，RFFIT）和ELISA 法检测病毒滴度和抗原含量，分析不同来源细胞对CTN-1 株的敏感性。结果显示，Vero细胞培养的CTN-1 株病毒滴度在第8 天达到高峰，为7. 80 lgFFD50／ mL，BHK-21 细胞在第6 天达到高峰，为7. 30 lgFFD50／ mL，而MDCK 细胞在第6 天仅为5. 55 lgFFD50／ mL。BHK-21 细胞培养的CTN-1株抗原含量值在各代次均高于Vero 和MDCK 细胞。表明Vero 和BHK-21 细胞对狂犬病病毒CTN-1 株的敏感性高于MDCK 细胞，且BHK-21 细胞产毒高峰较Vero 细胞提前。

孙燕等［10］初步建立了无血清培养Vero 细胞制备狂犬病病毒的方法，为大规模制备无血清狂犬病疫苗奠定了基础。研究采用无血清培养基（VP-SFM）和含5%牛血清的DMEM 培养基培养Vero 细胞，制备狂犬病病毒CTN-1V 株，比较无血清培养基培养的不同代次Vero 细胞及含血清培养基培养的Vero细胞制备的病毒的滴度和效价。向250 mL 摇瓶中加入2 g／L 微载体cytodex-1，加入Vero 细胞后37 ℃培养3 d，按MOI = 0. 02 感染狂犬病病毒CTN-1V株，检测病毒收获液的病毒滴度及效力，每日镜下观察细胞生长状况，计算比细胞生长率。结果显示，在无血清培养基中培养的Vero 细胞制备的病毒的滴度及效价差异无统计学意义（P ＞0. 05）；在无血清和含血清培养基中培养的Vero 细胞制备的病毒的效价差异无统计学意义（P ＞0.05）。无血清培养Vero细胞制备的病毒的效果优于含血清培养基（P ＜0.05）。用搅拌瓶微载体培养Vero 细胞制备狂犬病病毒，细胞黏附均匀，生长良好。收获病毒液的平均滴度为6. 50 lgFFU ／ mL，平均效力为6. 77 IU ／ mL。

1. 2 在鸡胚细胞上的适应性 GUO 等［11］、李慧等［12］、ZHU 等［13］在研究CTN-1 株适应鸡胚细胞方面取得了进展，并研究了CTN-1 株在鸡胚细胞驯化过程中的特性。利用RT-PCR 反应扩增CTN-1 株19 个代次的G 蛋白基因，获得cDNA 进行序列测定，并采用免疫荧光法测定各代次毒株在细胞中的滴度。序列测定结果显示，CTN-1 株在鸡胚细胞驯化过程中G蛋白基因序列发生不同程度变异且逐步积累，从第30 代开始，趋于稳定。与CTN-1 株相比，鸡胚细胞驯化株在G 蛋白的第147、333、389、421 和485 位氨基酸发生了突变。与此对应，CTN-1 株鸡胚细胞驯化株滴度逐渐趋于稳定，第33 ～58 代滴度维持在7. 0 ～7. 5 lgFFU ／ mL。G 蛋白同源性分析结果表明，CTN-1 株鸡胚细胞驯化株与我国近期不同区域分离得到的街毒株具有较高同源性，其G 蛋白氨基酸同源性为89. 3% ～99%。CTN-1 株在鸡胚细胞驯化过程中G 蛋白基因发生稳定变异，滴度在传代后33 ～58 代达到较高水平，稳定性较好。将CTN-1株在鸡胚细胞的适应株命名为CTNCEC25 株。

王春华等［14］证实CTNCEC25 株是高度减毒、不易返祖的弱毒株，其在鸡胚细胞上可稳定、快速增殖，病毒滴度高（＞7. 0 lgFFU ／ mL），是安全性较高的狂犬病疫苗候选毒株。研究狂犬病病毒CTNCEC25株的增殖能力、病毒感染力及致病力等表型特征，为将该毒株应用于疫苗生产提供了参考。将CTNCEC25株及其母株CTN-1 株分别接种Vero、原代鸡胚成纤维细胞（CEC 细胞）和小鼠神经瘤母细胞（N2a 细胞），观察细胞病变及复制规律；以脑内注射的方式接种动物，观察其对乳鼠、小鼠、豚鼠及家兔等动物的致病力；同时还将CTNCEC25 株在CEC 细胞上连续传20 代，在乳鼠脑内传3 代，观察其增殖能力、病毒感染力及致病力。结果表明，与母株CTN-1 株相比，CTNCEC25 株在Vero 和N2a 细胞上的增殖无显著差异，但在CEC 细胞上有明显优势，72 h 滴度可达7. 5 ～7. 6 lgFFU ／ mL，而CTN-1 株滴度仅为5. 8 lgFFU ／ mL；此外CTNCEC25 株在N2a、Vero 及CEC 细胞上均可产生明显的细胞病变。脑内致病力结果显示，CTNCEC25 株虽然对1 ～3 日龄乳鼠仍有较强脑内致病性，但对成年小鼠脑内致病力大大减弱，对豚鼠和家兔不致病。经细胞和乳鼠脑内连续传代，CTNCEC25 株在CEC 细胞上增殖稳定，其减弱的毒力并未回升，无弱毒返祖现象。

郭采平等［15］对CTNCEC25 株在CEC 细胞上的培养工艺进行了研究，以M199 为基础培养基，分别加入人血白蛋白、胎牛血清及HEPES 缓冲液，并均加入碳酸氢钠，配制培养基M1、M2 和M3。将驯化获得的CTNCEC25 株按1 ∶5 000 的比例接种至CEC细胞悬液中，在不同培养条件下，初步确定培养基配方、温度、MOI 和时间4 大工艺参数范围，再以正交试验确定上述条件的最佳组合。单因素试验初步确定的工艺参数：采用M2 或M3，培养温度33 ～36 ℃，MOI=0.01 ～0.001 FFU／细胞，培养时间72 ～120 h，可获得较高的病毒滴度（7. 0 lgFFU ／ mL 以上）。正交试验确定的最佳工艺条件：采用M3，培养温度33 ℃，MOI = 0. 01 FFU ／ 细胞，培养时间120 h，获得的病毒滴度达7. 5 lgFFU ／ mL。优化了CEC 细胞培养狂犬病病毒的工艺，CTNCEC25 株的病毒滴度由6. 0 lgFFU ／ mL 左右提高至7. 0 lgFFU ／ mL 以上，为获得理想疫苗抗原量积累了数据。

1. 3 在二倍体细胞上的适应性 毛子安等［16］的研究显示，将狂犬病病毒固定毒株CTN-1 连续在人二倍体细胞（KMB17）中传代，并以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒，从而获得适应于人二倍体细胞（KMB17）并具有良好免疫原性和传代稳定性的狂犬病病毒株，培育出可在人二倍体细胞（KMB17）高效增殖的狂犬病疫苗毒种（CTN-DK 株）。用该毒种生产人二倍体细胞（KMB17）狂犬病疫苗可有效避免当前国内使用的疫苗中异种DNA 残留引起的风险，将进一步提高我国狂犬病疫苗的安全性及实用性，具有重大的社会效益和经济效益。

何丽芳等［17］、MA 等［18］、徐道俊等［19］用狂犬病病毒固定毒CTN-1V 株经昆明鼠脑内传代后的病毒接种人胚肺二倍体细胞Walvax-2，连续传代后检测各代病毒的滴度及免疫原性。结果显示，CTN-1V株能较好地适应Walvax-2 细胞，通过连续带毒传代至第7 代，病毒滴度可达6. 78 lgLD50／ mL，第10 ～15 代内滴度可以维持在7.0 lgLD50／mL 以上，第15 ～30 代滴度稳定在7. 0 lgLD50／ mL 左右。以15 代适应毒株CTN-1V-HDC P15 制备的疫苗原液，各项指标均符合《中国药典》三部（2010 版）通用要求，疫苗效力在6. 0 IU ／ 剂以上。用0. 05 MOI 接种病毒，采用的人二倍体细胞量≥2 × 108个，37 ℃悬浮混合吸附30 min，用DMEM + 0. 3%人血白蛋白作为病毒维持液（pH 7. 8 ～8. 0），换液3 d 后开始收获病毒液，之后再进行5 ～7 d 病毒液的收获，经动物法和细胞法检测收获液病毒滴度。结果显示，3 次收获液病毒滴度均＞7. 0 lgLD50／ mL。建立了稳定的狂犬病病毒株CTN-1V 在Walvax-2 细胞上的病毒收获液制备工艺。Walvax-2 细胞传代适应狂犬病病毒固定株CTN-1V-HDC，可用于人用狂犬病疫苗的生产开发。

崔栋等［20］一项涉及微生物及生物制药领域的研究中，将狂犬病病毒株CTN-1V 在二倍体细胞MRC-5 的适应株命名为SNK-CTN 株。该病毒株通过以下方法制备：取MRC-5 细胞复苏培养3 d 成单层细胞后，用0. 25%胰酶消化分散成均匀细胞，按0. 01 ～1. 0 MOI 接种狂犬病病毒CTN-1V5 株悬液，37 ℃培养2 ～3 d；更换为含2% ～4%牛血清的维持液，33 ～35 ℃培养3 ～5 d；收获病毒液，-70 ℃冻存，制备成病毒悬液；用上述方法连续在MRC-5 细胞上传30 ～32 代。

1. 4 在原代地鼠肾细胞上的适应性 早在2002 年，张玉慧等［21］曾经尝试将CTN-1 株在原代地鼠肾细胞（PHKC）上传代适应，经10 多代适应性传代后，病毒滴度达7. 0 lgLD50／ mL，并应用适应株（CTNLS-HK）细胞毒种制备了3 批疫苗，效力为6. 11 ～6. 55 IU ／ mL。

2 基因特性

2. 1 糖蛋白（G）和核蛋白（N）的基因特性 狂犬病病毒糖蛋白（G）是决定抗原性、组织嗜性及毒力的最重要部分［22］。董关木等［5］完成CTN-1 株在Vero细胞上的适应性传代后（即CTN-1V），吴小红等［23］在2003 年随即开展了CTN-1 株糖蛋白测序工作，利用RT-PCR 反应从感染CTN-1V 的Vero 细胞中获得糖蛋白全长cDNA 片段，并克隆至PCR2. 1 载体后进行序列测定。结果显示，CTN-1V 株糖蛋白cDNA 序列长度为1 575 个核苷酸，编码524 个氨基酸。与国内外已测定的狂犬病病毒糖蛋白序列，如aG、CGX89-1、SBD 07、CVS、HEP-Flury、N. HL、ERA、PV、RC-HL、SAD B19、Nisss higah aam 和Vnukovo-32，进行同源性比较，核苷酸同源性为80. 8% ～92. 4%，氨基酸同源性为82. 9% ～93. 3%。其中，CTN-1V 糖蛋白与国内分离自广西的街毒株CGX89-1、分离自上海的街毒株SBD07 的氨基酸同源性高达85. 5% ～93. 3%，提示CTN-1V 株与国内流行株的基因结构一致，可预测CTN-1 株狂犬病疫苗对国内街毒株具有较好的保护作用。

明平刚等［24］将CTN-1-V5 株（Vero 细胞适应株第5 代）在鼠脑内连续传代至35 代，选取CTN-1-V7、CTN-1-V28 和CTN-1-V35 共3 个代次的毒株进行糖蛋白序列测定。结果表明，3 代CTN-1-V 株与我国目前使用的疫苗株CTN-1-V5 的核苷酸序列及相应的氨基酸序列同源性均较高，亲缘关系均较近，表明CTN-1-V 株尽管传代次数不同、传代方式不同，但仍然保持相当的稳定性；在进化树上，3 个代次CTN-1-V 非常接近，肯定了其作为狂犬病病毒疫苗株的有效性。

而孟胜利等［25］在明平刚等［24］研究的基础上挑选CTN-1-7、CTN-1-26、CTN-1-27、C TN-1-28、CTN-1-29、CTN-1-30、CTN-1-33 和CTN-1-35 共8 个代次的毒株进行核蛋白和糖蛋白的序列测定。结果显示，CTN-1 株8 个代次之间的核苷酸序列几乎完全相同。CTN-1 株在传代过程中N 和G 基因变异小，与中国流行的代表性街毒株的同源性高于其他疫苗株。与我国分离的街毒株相比，核苷酸的同源性分别为84. 2% ～95 0%和80. 4% ～94. 3%，氨基酸同源性分别为92. 1% ～99. 6%和88. 7% ～98. 5%。

2. 2 全基因序列的基因特性 2010 年，吴小红等［23］的观点得到了另一项研究的证实。在该项研究中，石磊泰等［26］首次对我国狂犬病疫苗生产株CTN-1进行了全序列测定及分析。利用RT-PCR 方法分段扩增CTN-1 株全基因组序列，随后进行测序，用Meg-Align 软件比较CTN-1 株全序列与国内外狂犬病病毒疫苗株、街毒株全序列的同源性，再以糖蛋白G 基因为模板，用ClustalX 和MEGA4 软件进行系统进化分析。结果显示，CTN-1 株全序列长度为11 925 nt（GenBank 登录号：FJ959397），为基因Ⅰ型，与国内外狂犬病疫苗株、街毒株全序列之间的同源性为81. 5% ～93. 4%，与美国蝙蝠分离株SHBRV18 的同源性最低，仅为81. 5%，与中国新分离的野毒株HN10 的同源性最高，为93. 4%。系统进化分析显示，CTN-1 株与国内大多数街毒株聚类于同一组内，而我国另一疫苗株aG 株与Flury、PM、PV、ERA、RC2HL 等疫苗株和少数中国街毒株聚类于另一组内。G 基因氨基酸对比显示，CTN-1 株与国内大多数街毒株的同源性高于其他疫苗株。表明CTN-1 株较其他疫苗株更适合用于预防我国的狂犬病，这一结论为CTN-1株在我国实际应用中的优势奠定了理论基础。需要注意的是，该结论在2020 年被印度的T. Nagarajan 和美国的C. E. Rupprecht 曲解和错误引用，因为他们否认同源性分析用于说明毒株亲缘关系的作用［27］。

2018 年的另一篇报道证实了石磊泰等［26］的研究结论。卢学新等［28］的这篇报道涉及了CTN-1 株的研究，他们通过RT-PCR 法获取CTN-1 株主种子批的全基因组序列，与国内分离的全基因组序列进行比对，并对狂犬病病毒主要抗原进行比对分析，结果显示，CTN-1 株与我国街毒株的亲缘关系更近，符合作为疫苗候选株的要求。

3 免疫保护

3. 1 暴露前免疫保护 CTN-1 株用于人体的免疫原性的报道较早的文献可能是于伟等［29］2001 年的一项研究，他们以Vero 细胞为基质，以CTN-1V10 为生产毒株，以＜150 代Vero 细胞为培养基质，采用转瓶旋转培养，按不同时间收获病毒液，经澄清、浓缩、纯化、灭活制成精制Vero 细胞狂犬病疫苗。从以此工艺制备的疫苗中选取1 批为免疫学效果观察的受试疫苗。按暴露后免疫程序接种63 人，其中受试疫苗接种33 人，法国维尔博狂犬病疫苗接种30 人，观察不良反应并检测中和抗体。结果显示，新研制的精制Vero 细胞狂犬病疫苗各项指标完全符合WHO的相关质量要求。两种疫苗全程免疫后中和抗体阳转率均为100%，中和抗体受试组为11. 94 IU ／ mL，维尔博疫苗对照组为11. 69 IU ／ mL。表明CTN-1精制Vero 细胞人用狂犬病疫苗不但制造工艺合理，且副反应轻微，免疫原性良好。

钱浩等［30］的一项研究也观察到了类似的现象，他们选择20 例健康受试者接种应用CTN-1V 株毒种制备的狂犬病疫苗，观察接种者的不良反应并检测中和抗体。结果显示，接种者不良反应率为35%（7／20），中和抗体阳转率为100%，免疫后14 d 中和抗体水平平均为13.08 IU／ mL（5.83 ～22.16 IU／mL）。表明CTN-1V 株毒种不良反应轻微且免疫原性良好，可在短时间产生较高水平的中和抗体。

陈伟等［31］为了观察人用冻干狂犬病疫苗（Vero细胞／ CTN 疫苗株）的安全性、免疫原性和抗体持久性，进行了大规模人群的研究。将450 名健康志愿者随机分为2 组，300 人（试验组）接种人用冻干狂犬病疫苗，150 人（对照组）接种进口冻干狂犬病纯化疫苗。按照0、3、7、14、28 d 免疫程序，观察每针次接种后局部和全身反应，采用RFFIT 试验检测0、3、7、14、28 d 血清中和抗体水平（GMT）。初次免疫后365 d，采集试验组血液样本212 份，对照组血液样本97 份；初次免疫后730 d，采集试验组血液样本176 份，对照组血液样本80 份。结果显示，接种者均未出现严重的局部或全身反应。初次免疫后3、7、14、28、365 和730 d，试验组抗体阳转率分别为2.35%、80. 78%、100. 00%、100. 00%、98. 58%和73. 30%，GMT 分别为0.12、1.01、9.83、12.61、3.68 和2.81IU／mL；对照组抗体阳转率分别为4.00%、87.20%、100.00%、100. 00%、97. 94%和76. 25%，GMT 分别为0. 13、1. 18、10. 24、11. 61、4. 18 和1. 92 IU ／ ml。试验组与对照组相比，差异无统计学意义（P ＞0. 05）。表明人用冻干狂犬病疫苗（Vero 细胞／ CTN 疫苗株）具有良好的安全性、免疫原性和抗体持久性。

2017 年黄莉荣等［32］针对国内一家即将上市销售的、以CTN-1 株生产的冻干人用狂犬病疫苗（Vero细胞）进行了安全性和免疫原性考察。在广西岑溪市和苍梧县共选择1 200 名10 ～60 岁健康受试者。采用随机、盲法、阳性对照试验设计。将1 200 名受试者按1 ∶1 的比例随机配对，接种试验疫苗和对照疫苗（市场上同类产品）。按第0、3、7、14 和28 天的免疫程序，在初次接种疫苗后42 d 的随访期间观察到全身和局部不良反应。初次接种后第14 和42 天采集血样，采用RFFIT 试验检测狂犬病病毒中和抗体，计算抗体几何平均浓度（GMC）。结果显示，1 199名受试者完成了安全性观察。试验疫苗组（600 例）和对照疫苗组（599 例）全身反应发生率分别为12.33%和18. 03%（P ＜0. 05），常见症状为发热（发生率分别为8. 00%和13. 19%），局部反应发生率分别为5. 33%和10. 52%（P ＜0. 05）。同时观察了1 147 名受试者的免疫原性。初次免疫后，试验疫苗组（571例）和对照疫苗组（576 例）抗体阳转率在第14 天分别为100. 00%和99. 83%，第42 天均为100. 00%，差异均无统计学意义（P ＞0. 05）；第14 天抗体GMC分别为8. 94 和7. 96 IU ／ mL，第42 天分别为17. 26和15. 04 IU ／ mL，差异均有统计学意义（P ＜0. 05）。表明冻干人用狂犬病疫苗（Vero 细胞／ CTN-1 株）具有良好的安全性及免疫原性。目前该疫苗已于2017年上市，2019 年的批签发量为202. 4 万支［33］。

2018 年黄腾等［34］进行了一项评价国产CTN-1V 株人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）在10 ～60 岁健康受试者中的安全性及免疫原性的研究。他们使用了同类产品的随机、盲目、并行控制设计。将广西永福县的900 名受试者随机配对，以2 ∶1 的比例接种试验疫苗和对照疫苗，观察安全性。所有受试者均在初次免疫前以及免疫后14 和45 d 采集静脉血，经RFFIT 试验检测血清中抗狂犬病病毒的中和抗体效价，计算GMC。结果显示，试验组和对照组不良反应发生率分别为32. 33%和38. 67%（P ＜0. 05）。接种部位的局部反应主要为疼痛、发红、肿胀和瘙痒，而全身反应主要为发烧、头痛和疲劳，且大多数是轻度（1 级）。免疫后14 和45 d，试验组狂犬病病毒中和抗体阳转率均为100. 00%，GMC 分别为9. 96 和28. 83 IU ／ mL，差异无统计学意义（P ＞0. 05）。表明国产CTN-1V 株人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）具有良好的安全性和免疫原性。目前该疫苗也于2017 年上市，2019 年的批签发量为128. 3 万支［32］。

3. 2 暴露后免疫保护 程满荣等［35］在2008 年进行了关于CTN-1 株疫苗暴露后免疫的研究。他们用CTN-1 株疫苗免疫小鼠，用3 株具有代表性的街毒株CQ92、HN06、J 和标准攻击毒株CVS 经脑内和肌肉攻击，以未免疫小鼠的脑内和肌肉攻击为对照，观察CTN-1 株疫苗的保护效果。结果显示，原倍和5 倍稀释的疫苗免疫的小鼠经3 株街毒肌肉攻击后，均获得100%的保护，与对照组比较，差异均有统计学意义（P ＜0. 05）；原倍疫苗免疫的小鼠经3 株街毒脑内攻击后，均获得100%的保护，5 倍稀释的疫苗免疫的小鼠对3 株街毒CQ92、HN06、J 的保护率分别为85%、75%和77. 8%，与对照组比较，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。基于动物实验数据得出CTN-1株疫苗总体上能有效预防我国目前狂犬病的流行。

4 结 语

1994年10月—2001年10月中国药品生物制品检定所（现中国食品药品检定研究院）董关木等［36］利用卫生部科技贷款和自筹资金，将我国自行分离、减毒的狂犬病病毒CTN-1 株适应于Vero 细胞。该病毒在Vero 细胞中增殖迅速，病毒滴度可达8.0 lgLD50／mL以上，产量高且免疫原性好，该病毒已被国家食品药品监督管理局正式批准为人用狂犬病疫苗生产用毒种，并于2005 年被WHO 正式出版的文件（WHO TRS 941）确认为人用疫苗的毒种［37］。

狂犬病病毒CTN-1 株在我国分离、驯化、减毒、建立和应用，具有自主知识产权，并已完全适应Vero细胞，具有效价高、免疫原性好、浓缩倍数少、生产成本低等优点，对人群有较好的保护作用。经生物学、免疫学、免疫化学、分子生物学、基因测序和动物流行病学等综合验证，该毒株符合国家［38］和WHO［39］相关人类疫苗生产的要求和质量标准，目前已实现产业化生产。

CTN-1 株完全适应于Vero 细胞后，2001 获得新药证书，目前已投入规模化生产，先后有7 家公司实施产业化生产。由于CTN-1 株与我国街毒株亲缘关系更近，因此更适用于制备我国预防狂犬病的疫苗。

近年来，有不少研究单位及生产机构用CTN-1 株在鸡胚细胞和二倍体细胞上进行适应性传代，也已取得实质性进展［11-20］；还有机构发明了以CTN-1 株为模板构建的mRNA 人用狂犬病疫苗［40］。期待不同细胞基质培养的、新型的CTN-1 株人用狂犬病疫苗早日上市，为实现早日消除狂犬病的目标而努力。