缺氧诱导因子-1α在早期妊娠中的研究进展

郭慧慧,郝晓莹,郭烨,贾青青

人类子宫内膜的损伤与修复、胚胎植入、蜕膜化、滋养细胞的增殖分化与侵袭、胎盘形成、胚胎形成和胚胎发育都是在相对缺氧的环境中进行的。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是机体在缺氧条件下呈指数增长的一种缺氧依赖性的转录因子，广泛参与机体的血管形成、细胞增殖和迁移、胚胎形成和发育。本文就HIF-1α在早期妊娠中研究进展做一综述。

1 缺氧诱导因子-1α的结构、调控及功能

HIF-1是一种广泛存在于人和哺乳动物细胞内的缺氧应答调控因子，可调节低氧条件下基因的表达。HIF-1的编码基因位于14号染色体(14q21～q24)，由1个位于细胞质内的氧调节α亚基(HIF-1α)和3个位于细胞核内组成性表达β亚基(HIF-1β)组成的异二聚体蛋白[1]。HIF-1α包含的碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)和Per/ARNT/Sim(PAS)结构域参与了HIF异源二聚体的形成和特异性结合目标DNA序列，此外，HIF-1α还包含氧依赖性降解(oxygen-dependent degradation，ODD)结构域和两个转录激活结构域。在哺乳动物中，脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase，PHD)和天冬酰胺基羟化酶抑制HIF因子调节HIF的稳定性和转录活性[2]。

对HIF-1的活性起决定作用是HIF-1α，其是一种对缺氧依赖性很强的氧调节蛋白。在常氧条件下，PHD可以降解其ODD结构域中的Pro402和Pro564残基，进而使其羟基化。羟基化的HIF-1α进一步与VHL肿瘤抑制蛋白(von-Hippel-Lindau tumor suppressor protein，pVHL)结合，募集泛素蛋白形成泛素连接蛋白酶复合体，导致HIF-1α经泛素-蛋白酶体途径快速降解。在缺氧条件下，PHD活性降低使HIF-1α无法通过泛素连接蛋白酶复合体途径降解。降解受阻的HIF-1α与HIF-1β形成二聚体后与缺氧反应原件上的HIF-1α结合位点结合，诱导下游100多种缺氧反应基因的转录，参与血管生成、细胞能量代谢、细胞增殖和细胞凋亡等[3]。

2 缺氧诱导因子-1α参与子宫内膜的修复

子宫内膜周期性破坏和修复对于正常月经和成功妊娠至关重要[4]。子宫内膜组织缺氧是发生在经前的生理事件。Cousins等[5]使用低氧探针TM检测系统，检测小鼠月经样模型中子宫内膜破裂和修复时的氧分压，显示月经期子宫内膜中存在着空间和时间上的缺氧梯度。有学者发现HIF-1α参与人月经期子宫内膜的修复，在分泌期高表达并在分泌晚期达到高峰[6]。Maybin等[7]的进一步研究发现HIF-1α参与了缺氧引起的人月经期间子宫内膜血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的产生，并且VEGF在子宫内膜修复期增加。月经期的子宫内膜会出现短暂的生理性缺氧，来稳定子宫内膜中的HIF-1α，诱导VEGF产生，从而使剥脱的子宫内膜表面得到及时修复[8]。Chen等[4]进一步在小鼠月经样模型中检测HIF-1α和VEGFmRNA，发现HIF-1α和VEGFmRNA表达在子宫内膜突破性出血期间均显著增加，更深入的研究显示HIF-1α的激活和HIF-1α与VEGF启动子的直接结合也达到峰值，表明HIF-1α在月经期间直接调控VEGFmRNA表达，并且这种调控在子宫内膜突破性出血时开始并直接达到高峰。此外，Maybin等[9]的体内外实验表明HIF-1α可诱导子宫内膜修复时肾上腺髓质素的高表达，刺激内皮细胞增殖和管状形成，诱导血管生成和淋巴管生成。也有研究表明，HIF-1α的激活可以通过抑制子宫内膜间质细胞中双特异性磷酸酶2的表达从而导致环氧化酶2过表达，从而增加雌激素的产生和雌激素受体的表达[10]，促进子宫内膜的修复。Greenhill[11]发现月经过多妇女子宫内膜活检样本中的HIF-1α水平低于月经正常的妇女，月经过多妇女的月经持续时间也更长。随后给予切除卵巢的小鼠雌激素和孕激素模拟月经，在这些小鼠的月经期子宫内膜中出现缺氧并导致HIF-1α水平升高，在富氧条件下子宫内膜中HIF-1α水平降低，子宫内膜修复延迟，在月经期给予抑制HIF-1α与靶基因缺氧反应元件结合的棘霉素，导致小鼠子宫内膜延迟修复，而模拟月经前给小鼠注射HIF-1α的稳定剂(二甲酰甘氨酸)比给予赋形剂的小鼠子宫内膜修复效果更好，进一步验证HIF-1α在促进子宫内膜修复中的重要作用，从而为月经过多患者的治疗提供了新的临床思路。目前关于HIF-1α促进子宫内膜修复的研究有限，且HIF-1α主要通过上调VEGF、肾上腺髓质素及雌激素的表达促进子宫内膜的修复，但仍可在多方面展开深入研究。

3 缺氧诱导因子-1α与胚胎植入、蜕膜化

3.1 缺氧诱导因子-1α促进胚胎植入

人类胚胎植入是在缺氧环境中进行的，缺氧诱导合成的HIF-1α改变了子宫内膜微环境，有助于改善子宫内膜的接受能力[12]。Jenog等[13]在建立的猪滋养外胚层细胞的体外实验发现慢性低氧诱导的HIF-1α通过上调转录因子(p21和p27)的同时，下调细胞周期调节因子(细胞周期素D1和细胞周期素E1)基因的表达，导致G1/S细胞周期短暂停滞，有利于植入前胚胎通过细胞内的反应适应子宫环境中的低氧浓度。Zhao等[12]观察到，在植入窗口期子宫内膜中，多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)患者HIF-1α和VEGF 的mRNA及蛋白表达水平较正常组明显降低，并且VEGF的低表达使子宫内膜血管密度降低，影响子宫内膜的血管化，最终导致胚胎植入失败。Yu等[14]观察到与对照组相比胚胎反复种植失败(recurrent implantation failure，RIF)妇女子宫内膜中的HIF-1α表达下调，微血管密度明显低于对照组，表明子宫内膜HIF-1α表达和血管生成的降低可能导致植入失败，随后分析RIF和对照组在子宫内膜取样器进行宫腔操作造成子宫内膜机械损伤前后子宫内膜中的HIF-1α表达和微血管密度，发现子宫内膜损伤增加了子宫内膜样本中HIF-1α的表达和微血管密度，表明子宫内膜机械损伤促进缺氧反应，损伤的子宫内膜产生的HIF-1α刺激其他趋化因子和细胞因子的分泌，进而促进子宫内膜血管生成。Gou等[15]观察到微管解聚蛋白1(Stathmin 1,Stmn1)在着床第5天的小鼠子宫内膜腺上皮、血管内皮、管腔上皮及底层基质细胞中广泛表达，随后通过一侧宫角宫腔内注入Stmn1-siRNA建立Stmn1敲低的小鼠模型，观察到的Stmn1敲低的小鼠植入胚胎数低于正常妊娠小鼠，同时发现在着床第5天着床部位的HIF-1α、VEGF和蜕膜生物标志物(催乳素和胰岛素样生长因子)的表达均下调，表明胚胎植入过程中下调Stmn1基因可通过抑制HIF-1α和VEGF的表达来抑制蜕膜化，从而导致胚胎植入受损。目前HIF-1α/VEGF通路影响子宫内膜血管形成促进胚胎植入为HIF-1α参与胚胎植入的主要通路，但HIF-1α作为很多蛋白激酶的底物，通过其他途径参与胚胎植入的研究较少，仍有待进一步研究。

有学者就HIF-1α与整合素参与胚胎植入进行相关研究，Na等[16]通过RT-PCR分析缺氧条件下HTR-8/SVneo滋养细胞中整合素的表达及与暴露时间的依赖性发现，缺氧状态下整合素α3和β1均持续表达，整合素α5、α6、β7的表达随着缺氧而逐渐升高，整合素α4(integrin α4，ITGA4)在缺氧早期表达较弱，但在缺氧条件下表达增加，表明HIF -1α的表达可能改变整合素α4、α5、β1和β7的表达，特别在缺氧早期ITGA4的表达可能受到HIF -1α表达的负调控，并且ITGA4下调可促进滋养细胞的侵袭，在胚胎植入过程中起重要作用。Köstlin-Gille等[17]发现野生型和髓系HIF-1α敲低的小鼠脾和子宫骨髓源性抑制细胞(myeloid derived suppressor cells，MDSC)中CXC趋化因子受体1、2、4、5的表达没有差异，但髓系HIF-1α基因敲除的小鼠MDSC中ITGA4、整合素β3(integrinβ3，ITGB3)、整合素β2(integrinβ2，ITGB2)表达上调，再次表明HIF-1α对ITGA4的负调控，但HIF-1α调控ITGA4及ITGA4促进滋养细胞侵袭有利于胚胎植入的具体机制尚未见报道，有待进一步研究。

3.2 缺氧诱导因子-1α促进子宫内膜蜕膜化

胚胎着床后，子宫内膜基质细胞转化为蜕膜细胞(蜕膜化)以支持进一步妊娠，成功的蜕膜化是妊娠的先决条件。在小鼠的蜕膜化过程中，孕激素可通过PI3K/AKT信号通路激活HIF-1α，使子宫内膜基质细胞依赖有氧糖酵解，同时蜕膜细胞和子宫内膜基质细胞之间的乳酸穿梭使得细胞外液中乳酸增高，导致HIF-1α稳定进一步促进未分化子宫内膜基质细胞的增殖[18]。HIF-1α可以激活缺氧敏感基因葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter protein，GLUT1)，而GLUT1被证明是对分泌子宫内膜蜕膜化所必须的[19]。Zhao等[12]进一步研究发现在PCOS患者中，GLUT1小泡转移到细胞膜上的数量减少，阻止子宫内膜细胞对葡萄糖的摄取，从而影响子宫内膜的蜕膜化。此外，Gou等[15]的研究表明胚胎植入过程中下调Stmn1基因可通过抑制HIF-1α和VEGF的表达来抑制蜕膜化，但VEGF调节内皮蜕膜细胞的机制有待进一步阐明。最后，Ji等[20]发现HIF-1α和促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)在蜕膜中高表达，尤其高表达于蜕膜基质细胞，其进一步的体外研究显示HIF-1α的沉默导致蜕膜基质细胞中EPO的低表达，表明HIF-1α在人孕早期蜕膜基质细胞中上调EPO的表达促进了蜕膜基质细胞的增殖并抑制其凋亡。

由上可知，HIF-1α通过上调VEGF和EPO表达促进子宫内膜蜕膜化。众所周知，子宫内膜蜕膜化是在相对缺氧的环境中进行的，HIF-1α作为一个关键的缺氧转录调节蛋白，广泛参与糖代谢、细胞的增殖与分化、血管形成以及免疫调节等途径，但目前相关途径在子宫内膜蜕膜化的研究十分有限。

4 缺氧诱导因子-1α参与滋养细胞的增殖、分化与侵袭

妊娠早期，植入后滋养细胞分化为绒毛滋养细胞和绒毛外滋养细胞(extravillous trophoblasts，EVT)。在此期间，滋养细胞暴露在一个相对低氧的环境中。低氧被认为是滋养细胞侵袭的主要刺激因子，也是正常胚胎和胎盘发育的必要条件[21]。缺氧转录调节因子HIF-1α可通过多种信号通路参与滋养细胞的侵袭。

HIF-1α可通过调节VEGF、基质金属蛋白酶12(matrix metalloproteinase 12，MMP12)和趋化因子受体4参与滋养细胞的侵袭。Dubinsky等[22]利用siRNA沉默JEG-3绒毛膜癌细胞中HIF-1α和VEGF的表达后发现细胞的增殖、迁移和浸润被显著抑制，表明HIF-1α和VEGF参与了滋养细胞的侵袭和迁移。Chakraborty等[23]的小鼠模型进一步显示HIF是赖氨酸脱乙酶3A表达的关键调控因子，赖氨酸脱乙酶3A的靶基因MMP12的高表达促进滋养细胞侵袭和滋养细胞引导的子宫螺旋动脉重构，表明HIF/赖氨酸脱乙酶3A/MMP12通路的激活可促进滋养细胞侵袭、滋养细胞引导的子宫螺旋动脉重构和胎盘对缺氧的适应。Hiden等[21]的进一步研究中应用启动子序列分析发现HIF-1上存在MMP12启动子的结合位点，加入HIF-1α激活剂去铁胺则上调了MMP12蛋白，表明HIF-1α通过直接与MMP12启动子结合诱导EVT表达，参与妊娠早期滋养细胞的侵袭。有学者的体外研究发现siRNA转染敲低HIF-1α暴露于3%氧气下的JEG3细胞中的趋化因子受体4表达明显降低，同时发现低表达趋化因子受体4的JEG3细胞的迁移和侵袭能力降低，表明缺氧条件下HIF-1α上调趋化因子受体4促进了滋养细胞的迁移和侵袭[24]。Fujita等[25]的进一步研究表明缺氧可通过PI3K-AKT-mTOR-HIF-1α和ERK-HIF-1α信号通路调节滋养细胞来源BeWo细胞的VEGF和内皮糖蛋白的表达，从而诱导滋养细胞血管生成，促进早期胎盘形成。HIF-1α作为多种激酶的转录调节因子，是否通过其他通路(如整合素、转化生长因子和黏附分子等)调节滋养细胞尚有待进一步研究。此外，有研究发现HIF-1α参与EVT血管内分化，Fukushima等[26]发现常氧状态下人EVT细胞的血管内分化过程中的HIF-1α表达上调，而且抑制HIF-1α可抑制VEGF表达和整合素αV(integrin αv，ITGAV)/ITGB3聚集，进而抑制血管的形成，表明常氧条件下HIF-1α主要通过VEGF/血管内整合素通路在基质诱导的EVT血管内分化中发挥重要作用。

Wu等[27]研究显示MiR-141在缺氧条件下可以促进滋养细胞的凋亡，抑制滋养细胞的侵袭和血管化能力。有学者观察到miR-362-3p/配对盒3(Paired box 3，Pax3)轴调控缺氧状态下滋养细胞的生存能力、迁移和侵袭能力[28]。有研究进一步发现 HIF-1α通过微小RNA参与滋养细胞的侵袭，Anton等[29]发现EVT暴露于氯化钴(HIF-1α稳定剂和缺氧模拟物)中，miR-210和HIF-1α呈剂量和时间依赖性增加，细胞侵袭降低，并且转染miR-210的EVT线粒体呼吸链功能降低，表明HIF-1α稳定时miR-210的过表达导致妊娠早期EVT线粒体功能障碍，出现活性氧增多，滋养细胞损伤使其侵袭能力降低。HIF-1α是否直接参与缺氧状态下miRNA调控滋养细胞侵袭、迁移及生存能力及其具体机制尚不清楚，仍有待深入研究。

由滋养细胞组成的胎盘在生理性缺氧环境下形成，而HIF-1α作为血管形成过程中缺氧关键调节因子，促进胎盘血管的发育[30]。有研究表明母体的HIF-1α是胎盘的形成所必须的，包括滋养细胞进入母体的蜕膜以及其他滋养细胞行为[31]。体外研究表明，低氧可减少滋养细胞的迁移和侵袭，表明子宫-胎盘低氧张力也可导致子痫前期(preeclampsia， PE)的浅层滋养细胞侵袭。相比之下，其他人的研究表明，初次分离的人类滋养细胞暴露于低氧环境(1%的氧气)会刺激滋养细胞的入侵，然而，这些相互矛盾的观察结果可能是由于使用了不同的细胞分离方法[32]。Yu等[33]观察到PE患者胎盘中跨膜融合蛋白1(Notch homolog 1，Notch1)、HIF-1α、内皮素B受体(endothelin receptor-B，ETBR)的低表达后进行体外小鼠实验，发现低氧上调HIF-1α、Notch1/ETBR的表达，表明低氧诱导的HIF-1α通过激活Notch1/ETBR信号通路，从而促进胎盘发育过程中滋养细胞的侵袭和血管生成。相反，Kosovic等[34]免疫组化发现妊娠合并PE胎盘绒毛滋养细胞和EVT中HIF-1α的表达较正常妊娠胎盘明显增高。Caniggia等[32]发现，与正常妊娠相比，PE胎盘滋养细胞中HIF-1α和其下游的转化生长因子β3(transforming growth factor-β3，TGF-β3)高表达，并且下调TGF-β3的表达可恢复滋养细胞的侵袭能力，表明HIF-1α通过上调TGF-β3的表达维持滋养细胞的未成熟表型导致滋养细胞侵袭不良。Zhao等[35]观察到早发型和晚发型重度PE患者胎盘组织中HIF-1α和toll样受体4的表达较对照组明显升高，随后在体外细胞实验中发现沉默HIF-1α可降低toll样受体4表达，从而促进人胎盘微血管内皮细胞增殖、侵袭、迁移和血管生成，但抑制人胎盘微血管内皮细胞凋亡，表明PE发病过程中HIF-1α通过调节toll样受体4的表达促进人胎盘微血管内皮细胞凋亡。

此外，HIF-1α参与了人脐静脉内皮细胞的生存迁移能力与人羊膜间充质干细胞的增殖。Li等[36]将miR-376b-5p模拟物或miR-376b-5p抑制剂转染低氧条件下人脐静脉内皮细胞，检测其增殖、迁移和管形成情况，并且将shRNA转染到细胞中来抑制HIF-1α表达比较各组间的血管生成和相关分子[包括HIF-1α、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)和Notch1]的表达，表明miR-376b-5p通过靶向HIF-1α介导的VEGFA/Notch1信号通路抑制低氧人脐静脉内皮细胞中的血管生成。有学者研究发现miR-153-3p下调促进HIF-1α/VEGFA/Notch1级联的激活，促进人脐静脉内皮细胞生存能力、迁移能力和血管形成[37]。HIF-1α是一种调节间充质干细胞增殖、凋亡和耐缺氧的核转录因子。缺氧条件下HIF-1α的过表达提高了人羊膜间充质干细胞的增殖活性和抗凋亡能力[38]，人羊膜间充质干细胞来源于人废弃胎盘表层的多潜能干细胞，具有良好的血管生成能力。

5 展望

HIF-1α作为一种氧依赖性转录因子，在促进子宫内膜的损伤修复、子宫接受态的建立、蜕膜细胞增殖、滋养细胞分化增殖侵袭、胎盘形成的过程中起重要作用，由此可见HIF-1α可作为自然流产、RIF、胚胎停育和重度PE等疾病新切入点。HIF-1α目前是国内外研究的热点，但大都是回顾性研究，且其具体病机制尚不清楚，有待对子宫内膜或血液进行前瞻性研究，为疾病的预防及治疗提供新的理论依据。